炎癥性腸?。↖BD）包括克羅恩?。–D）和潰瘍性結(jié)腸炎（UC），是一類以異常黏膜免疫反應(yīng)為特征的復(fù)雜疾病。它們由多種因素（如飲食、遺傳易感性、環(huán)境因素和黏膜免疫紊亂）引起，導(dǎo)致腸道炎癥和腸道屏障功能失調(diào)。IBD的病理特征包括腸道上皮細(xì)胞（IECs）的損傷、腸道微生物群失調(diào)以及免疫細(xì)胞的異常激活。鐵死亡是一種由鐵催化的脂質(zhì)過氧化引起的細(xì)胞死亡形式，與凋亡、壞死和焦亡等其他細(xì)胞死亡方式有明顯區(qū)別。鐵死亡在多種組織和細(xì)胞類型中發(fā)揮重要作用，并與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。文章指出，鐵死亡在腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，尤其是在維持腸道上皮細(xì)胞（IECs）的完整性方面。在IBD患者中，IECs的鐵死亡水平顯著增加，導(dǎo)致腸道屏障功能受損，從而加劇炎癥反應(yīng)。該研究于24年12月發(fā)表在《Journal of Clinical Investigation》，IF=13.3。

為了探索NEDD4L在腸道穩(wěn)態(tài)中的潛在功能，研究者首先分析了公共數(shù)據(jù)庫“人類蛋白質(zhì)圖譜”中的NEDD4L基因表達(dá)情況。NEDD4L基因在人類神經(jīng)系統(tǒng)、肺和腸道系統(tǒng)中高表達(dá)，尤其是在杯狀細(xì)胞中表達(dá)最高，而在人類免疫系統(tǒng)中表達(dá)較低，提示NEDD4L在腸道上皮中的高表達(dá)可能參與維持腸道穩(wěn)態(tài)。研究者分析了IBD患者中NEDD4L的基因表達(dá)，數(shù)據(jù)來自GEO數(shù)據(jù)庫。追蹤研究對象結(jié)腸活檢中NEDD4L蛋白的表達(dá)情況，如圖1的A-D所示，與健康對照組相比，UC和CD患者的IECs中NEDD4L蛋白水平顯著降低。在隊(duì)列1中，僅4.8%的UC患者活檢樣本（4/83）顯示出強(qiáng)NEDD4L免疫組化染色，而健康對照組中有20%（8/40）顯示出強(qiáng)NEDD4L IHC染色。在隊(duì)列2中，僅38.8%的UC患者活檢樣本（14/36）和39.0%的CD患者活檢樣本（16/41）顯示出強(qiáng)NEDD4L IHC染色，而健康對照組中有96.8%（30/31）顯示出強(qiáng)NEDD4L IHC染色。重要的是，與隊(duì)列2中輕度結(jié)腸炎患者相比，中度或重度結(jié)腸炎患者的NEDD4L蛋白表達(dá)水平更低（圖1的E和F），與GEO數(shù)據(jù)一致，表明NEDD4L表達(dá)與結(jié)腸炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步探索NEDD4L在IECs中的具體表達(dá)譜，研究者進(jìn)行了單細(xì)胞RNA分析。與健康組織相比，UC患者炎癥結(jié)腸組織中腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、增殖期細(xì)胞和干細(xì)胞中NEDD4L基因表達(dá)顯著降低，但在腸細(xì)胞祖細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、未成熟腸細(xì)胞、M細(xì)胞和簇細(xì)胞中變化不顯著。此外，與正常結(jié)腸黏膜相比，IBD患者的IECs中NEDD4L基因和蛋白表達(dá)顯著降低（圖1的G和H）。此外，在DSS處理的小鼠中，IECs中NEDD4L的基因和蛋白表達(dá)也顯著降低（圖1的I和J）。綜上所述，這些結(jié)果表明，無論是人類還是小鼠，NEDD4L基因和蛋白在結(jié)腸炎中均受到顯著抑制，且NEDD4L表達(dá)與IBD患者的結(jié)腸炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

為了研究NEDD4L在結(jié)腸炎中的作用，研究者首先用4% DSS誘導(dǎo)急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，對Nedd4l雜合敲除（Nedd4l+/–）小鼠和對照組野生型（Nedd4l+/+）小鼠進(jìn)行挑戰(zhàn)。與Nedd4l+/+小鼠相比，Nedd4l+/–小鼠的死亡率顯著更高（圖2A）。值得注意的是，與Nedd4l+/+小鼠相比，Nedd4l+/–小鼠在3% DSS處理后表現(xiàn)出更嚴(yán)重的結(jié)腸炎，表現(xiàn)為體重減輕更嚴(yán)重、直腸出血評分更高以及結(jié)腸縮短更明顯（圖2的B-F）。

為了進(jìn)一步探索NEDD4L在結(jié)腸炎中的保護(hù)作用是否與IECs內(nèi)在相關(guān)，研究者構(gòu)建了IECs特異性敲除Nedd4l的小鼠模型（Nedd4lfl/fl VillinCre）。與之前的研究一致，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠在穩(wěn)態(tài)條件下表現(xiàn)出正常的腸道組織學(xué)特征，其終末分化細(xì)胞與野生型小鼠無法區(qū)分。此外，兩組小鼠在細(xì)胞譜系分化方面沒有明顯差異。。然而，與對照組小鼠相比，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠在2.5% DSS處理時(shí)死亡率顯著更高（圖3A）。在2% DSS處理下，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的體重減輕、直腸出血、結(jié)腸縮短、上皮損傷以及腺體結(jié)構(gòu)破壞（圖3的B-F）。此外，5天DSS處理誘導(dǎo)了相當(dāng)程度的黏液中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤，但在Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠中，黏液中T細(xì)胞和B細(xì)胞的浸潤數(shù)量增加（圖3G）。此外，在結(jié)腸炎發(fā)展過程中，尤其是在第9天，與Nedd4lfl/fl小鼠相比，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的黏液中出現(xiàn)更多的炎癥免疫細(xì)胞浸潤，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞（圖3H）。

為了確定Nedd4l在IECs或造血細(xì)胞中的缺失是否對更嚴(yán)重的結(jié)腸炎表型有貢獻(xiàn)，研究者進(jìn)行了骨髓嵌合實(shí)驗(yàn)。將致死劑量輻射后的Nedd4l+/+（WT）和Nedd4l–/–（KO）小鼠用WT小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行重建。經(jīng)過DSS處理后，與Nedd4l+/+嵌合體（WT→WT）相比，非造血細(xì)胞中Nedd4l缺失的小鼠（WT→KO）表現(xiàn)出更嚴(yán)重的結(jié)腸炎表型（圖2的G-J）。這些數(shù)據(jù)表明，NEDD4L在非造血細(xì)胞中的缺失促進(jìn)了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制。

為了探索NEDD4L在調(diào)節(jié)結(jié)腸炎中的潛在機(jī)制，研究者對DSS處理的Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠和Nedd4lfl/fl對照小鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行了RNA測序分析。如圖4A所示，與Nedd4lfl/fl小鼠相比，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的緊密連接信號顯著下調(diào)。此外，與Nedd4lfl/fl小鼠相比，DSS處理后Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的血清FITC-葡聚糖濃度顯著更高，而在沒有DSS處理的情況下，兩組小鼠的上皮通透性相似（圖4B）。此外，通過緊密連接蛋白1（ZO-1）免疫熒光染色的組織病理學(xué)分析顯示，DSS處理后，Nedd4l缺失導(dǎo)致黏膜上皮中ZO-1的表達(dá)顯著降低（圖4C）。為了進(jìn)一步探索IECs中Nedd4l在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中對屏障完整性的調(diào)節(jié)作用，研究者對DSS處理或未處理的Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠和Nedd4lfl/fl小鼠的IECs進(jìn)行了定量泛素化質(zhì)譜分析。GO分析顯示，顯著變化的潛在底物主要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)定位、運(yùn)輸和運(yùn)輸活性。KEGG分析顯示，與Nedd4lfl/fl小鼠相比，IECs中蛋白質(zhì)消化和吸收、礦物質(zhì)吸收以及鐵死亡信號通路在Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠中顯著富集（圖4D）。與WT對照小鼠相比，DSS處理后Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的TUNEL+上皮細(xì)胞水平以及通過4-羥基壬烯醛（4-HNE）陽性細(xì)胞染色和丙二醛（MDA）含量測量的脂質(zhì)過氧化水平顯著增強(qiáng)，提示Nedd4l在IECs中的缺失促進(jìn)了DSS處理后IECs的脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖4的E-I）。與Nedd4lfl/fl小鼠相比，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的IECs表現(xiàn)出更嚴(yán)重的鐵死亡表型，其特征是線粒體碎片化，內(nèi)部嵴消失以及塌陷（圖4J）。與Nedd4lfl/fl小鼠相比，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠中Gpx4等鐵死亡和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著降低，TfR1、Ptgs2和Lcn2的基因表達(dá)水平顯著增加。此外，研究者用DSS和鐵死亡誘導(dǎo)劑（erastin、erastin 2和RSL3）刺激來自Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠和Nedd4lfl/fl小鼠的腸道類器官，以檢查NEDD4L是否介導(dǎo)IECs的鐵死亡。如圖4的K和L所示，Nedd4l在IECs中的缺失促進(jìn)了脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的IECs死亡，通過DAPI和FITC-BODIPY C11染色進(jìn)行評估。研究者的數(shù)據(jù)表明，NEDD4L通過抑制IECs的鐵死亡來維持腸道屏障完整性。研究者注意到，在DSS處理誘導(dǎo)結(jié)腸炎的過程中，小鼠IECs中NEDD4L基因和蛋白的表達(dá)受到抑制，提示DSS誘導(dǎo)的IECs鐵死亡可能是結(jié)腸炎中NEDD4L表達(dá)抑制的潛在誘導(dǎo)因素。因此，研究者使用鐵死亡誘導(dǎo)劑（erastin和RSL3）來闡明鐵死亡在NEDD4L表達(dá)中的作用。erastin和RSL3顯著抑制了NEDD4L蛋白的表達(dá)，提示細(xì)胞鐵死亡可能調(diào)節(jié)NEDD4L的表達(dá)。此外，其他經(jīng)典的細(xì)胞死亡方式，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡和凋亡也抑制了NEDD4L的表達(dá)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了NEDD4L以E3泛素連接酶活性依賴的方式負(fù)向調(diào)節(jié)DSS和鐵死亡誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生。在多種細(xì)胞系中，NEDD4L的缺失顯著促進(jìn)了erastin或RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了NEDD4L以E3泛素連接酶活性依賴的方式負(fù)向調(diào)節(jié)DSS和鐵死亡誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生。

基于定量泛素化質(zhì)譜分析，SLC3A2是一種跨膜蛋白，它與SLC7A11共同形成關(guān)鍵的谷氨酰胺/半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，并參與鐵死亡，被鑒定為NEDD4L顯著泛素化的底物之一。與Nedd4lfl/fl小鼠相比，DSS處理后Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠IECs中SLC3A2的表達(dá)顯著下調(diào)。然而，由于DSS處理導(dǎo)致NEDD4L表達(dá)降低，與未處理小鼠相比，SLC3A2的泛素化質(zhì)譜分析結(jié)果受到抑制（圖5的A和B）?；诙糠核鼗|(zhì)譜分析和相互作用質(zhì)譜分析的聯(lián)合分析，研究者假設(shè)NEDD4L可能與SLC3A2相互作用，并調(diào)節(jié)其泛素化，從而觸發(fā)IECs的鐵死亡并加劇DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。一致地，與Nedd4lfl/fl小鼠相比，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠IECs中SLC3A2的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而Nedd4l在IECs中的缺失對GP130和MEKK2的蛋白表達(dá)沒有影響，這兩種蛋白在其他細(xì)胞中已被鑒定為NEDD4L的潛在底物。此外，在DSS處理后，與Nedd4lfl/fl小鼠相比，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠IECs中SLC3A2的表達(dá)也下調(diào)（圖5C）。基于泛素化質(zhì)譜分析，研究者發(fā)現(xiàn)NEDD4L蛋白豐度與SLC3A2蛋白豐度呈正相關(guān)，進(jìn)一步表明SLC3A2可能是NEDD4L的潛在底物。據(jù)報(bào)道，SLC3A2通過調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞中cyclin D1的表達(dá)參與小鼠結(jié)腸炎。此外，研究者發(fā)現(xiàn)Nedd4l在IECs中的缺失限制了SLC3A2和GPX4蛋白的表達(dá)（圖5，C–E）。DSS處理顯著抑制了GPX4、SLC3A2和NEDD4L的蛋白表達(dá)水平。重要的是，IBD患者中NEDD4L的蛋白表達(dá)水平與SLC3A2呈正相關(guān)（圖5，F(xiàn)和G）。在腸道類器官和HCT116細(xì)胞中敲除NEDD4L會損害DSS誘導(dǎo)的SLC3A2和GPX4表達(dá)，但會增加TFRC表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞鐵死亡（圖5，H和I）。NEDD4L以E3泛素連接酶活性依賴的方式正向調(diào)節(jié)HCT116細(xì)胞中SLC3A2和GPX4蛋白的表達(dá)（圖6J）。在多種經(jīng)DSS、Erastin或RSL3處理的腸道細(xì)胞系中，使用siRNA沉默NEDD4L表達(dá)也觀察到了類似的結(jié)果（圖5，K–M）。

作為鐵死亡信號通路中NEDD4L的潛在底物，SLC3A2的研究相對較少。因此，研究者確定了SLC3A2是否能夠調(diào)節(jié)由DSS或鐵死亡誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。如圖6，A–I所示，沉默內(nèi)源性SLC3A2顯著促進(jìn)了由DSS和鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生。此外，與轉(zhuǎn)染了對照siRNA（siNC）的細(xì)胞相比，沉默內(nèi)源性SLC3A2在DSS或鐵死亡誘導(dǎo)劑處理后抑制了GPX4的表達(dá)，但增強(qiáng)了TFRC的表達(dá)。在HCT116細(xì)胞中過表達(dá)外源性SLC3A2通過上調(diào)GPX4的表達(dá)抑制了DSS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生（圖6，J–M），表明SLC3A2負(fù)向調(diào)節(jié)由DSS和鐵死亡誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡。此外，外源性SLC3A2的過表達(dá)消除了NEDD4L沉默和轉(zhuǎn)染了對照siRNA（siNC）的HCT116細(xì)胞之間DSS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物產(chǎn)生以及GPX4和TFRC蛋白表達(dá)水平的差異（圖6，N–P）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明NEDD4L通過SLC3A2/GPX4軸調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡。

為了確定NEDD4L調(diào)節(jié)SLC3A2蛋白表達(dá)的機(jī)制，研究者在HCT116和HEK293T細(xì)胞中研究了NEDD4L與SLC3A2之間的相互作用。如圖7，A和B所示，NEDD4L在DSS處理后與SLC3A2動態(tài)相互作用，在12小時(shí)達(dá)到峰值。NEDD4L的E3連接酶活性突變體（NEDD4L-C942A或NEDD4L-CA）消除了這種相互作用。為了確定NEDD4L與SLC3A2相互作用所需的結(jié)構(gòu)域，研究者構(gòu)建了一系列表達(dá)野生型NEDD4L或突變型NEDD4L的質(zhì)粒，其中分別缺失了C2、WW或HECT結(jié)構(gòu)域（ΔC2、ΔWW或ΔHECT）。如圖7C所示，缺失HECT結(jié)構(gòu)域（而非C2和WW結(jié)構(gòu)域）破壞了NEDD4L與SLC3A2之間的相互作用，表明HECT結(jié)構(gòu)域?qū)τ贜EDD4L與SLC3A2的結(jié)合是必需的。作為一種E3泛素連接酶，NEDD4L可能通過介導(dǎo)SLC3A2的泛素化來調(diào)節(jié)SLC3A2蛋白的穩(wěn)定性。首先，研究者使用泛素（Ub）抗體免疫沉淀內(nèi)源性Ub，以比較WT（sgNTC）和NEDD4L-KO（sgNEDD4L）HCT116細(xì)胞中多聚泛素化SLC3A2的量。如圖7D所示，NEDD4L在HCT116細(xì)胞中的敲除損害了DSS處理后SLC3A2的多聚泛素化，這與研究者在IECs的泛素化質(zhì)譜分析中觀察到的表型一致。隨后，研究者在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了泛素化實(shí)驗(yàn)。如圖7E和所示，NEDD4L正向調(diào)節(jié)SLC3A2的多聚泛素化。此外，體外無細(xì)胞泛素化實(shí)驗(yàn)表明，是WT NEDD4L蛋白（而非NEDD4L-C942A蛋白）直接促進(jìn)了SLC3A2的多聚泛素化（圖7F）。在MG132處理后（而非Bafilomycin A1處理后），轉(zhuǎn)染了WT NEDD4L的細(xì)胞中SLC3A2的表達(dá)降低到與轉(zhuǎn)染了對照或NEDD4L-CA突變體的HCT116細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃剑砻鱊EDD4L通過介導(dǎo)SLC3A2的泛素化以蛋白酶體依賴的方式調(diào)節(jié)SLC3A2蛋白的穩(wěn)定性。NEDD4L-ΔHECT完全失去了介導(dǎo)SLC3A2泛素化的能力（圖7G），表明NEDD4L的HECT結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄渑cSLC3A2的相互作用及其泛素化是關(guān)鍵的。此外，NEDD4L主要促進(jìn)了SLC3A2的賴氨酸63（K63O）連接的多聚泛素化（圖7H），這與HECT型E3連接酶和NEDD4家族連接酶（包括NEDD4L）的已知觀點(diǎn)一致，即C末端氨基酸決定了泛素鏈的特異性，這些連接酶對K63連接具有嚴(yán)格特異性。NEDD4L的敲除顯著損害了DSS誘導(dǎo)的SLC3A2的K63連接的多聚泛素化，但增強(qiáng)了SLC3A2的K48連接的多聚泛素化，導(dǎo)致與sgNTC HCT116細(xì)胞相比SLC3A2蛋白表達(dá)降低（圖7I）。此外，NEDD4L在HEK293T細(xì)胞中以劑量依賴的方式促進(jìn)了SLC3A2的K63連接的多聚泛素化，并抑制了SLC3A2的K48連接的多聚泛素化（圖8J）。這些數(shù)據(jù)表明，NEDD4L介導(dǎo)了SLC3A2的K63連接的多聚泛素化，但不涉及GPX4。

為了進(jìn)一步確定NEDD4L是否通過鐵死亡通路調(diào)節(jié)結(jié)腸炎，研究者對經(jīng)DSS處理的Nedd4lfl/fl VillinCre和Nedd4lfl/fl小鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行了RNA測序，以探索其潛在機(jī)制。富集分析顯示IL-17R信號可以影響IECs的穩(wěn)態(tài)、分化和腫瘤發(fā)展，研究者通過使用IL-17中和抗體來測試NEDD4L是否通過IL-17R信號調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。IL-17中和抗體處理成功抑制了WT小鼠中的DSS介導(dǎo)的結(jié)腸炎，但并未消除由Nedd4l缺失誘導(dǎo)的結(jié)腸炎表型差異。使用脂質(zhì)過氧化清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）處理顯著減輕了Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的結(jié)腸炎發(fā)展，并挽救了Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的結(jié)腸炎表型。

為了進(jìn)一步探索NEDD4L是否通過鐵死亡調(diào)節(jié)結(jié)腸炎，研究者在Nedd4lfl/fl VillinCre和Nedd4lfl/fl小鼠中持續(xù)腹腔注射鐵死亡特異性抑制劑ferrostatin-1（Fer-1），以抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。如圖8，A–J，F(xiàn)er-1顯著挽救了DSS誘導(dǎo)的Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的結(jié)腸炎表型，使其與經(jīng)Fer-1處理的Nedd4lfl/fl小鼠相當(dāng)，表現(xiàn)為腹瀉和直腸出血減少、結(jié)腸縮短減少、上皮損傷減輕、腺體結(jié)構(gòu)破壞減少、上皮細(xì)胞死亡減少、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物減少以及炎癥細(xì)胞因子減少，但緊密連接增加。此外，在結(jié)腸炎誘導(dǎo)期間持續(xù)腹腔注射Fer-1消除了Nedd4lfl/fl VillinCre和Nedd4lfl/fl小鼠之間的結(jié)腸炎表型差異。Fer-1處理消除了Nedd4lfl/fl VillinCre和Nedd4lfl/fl小鼠之間鐵死亡相關(guān)基因（包括Gpx4、Ncoa4、Acsf2和Acsl4）和蛋白（包括GPX4、SLC3A2和TFRC）表達(dá)的差異（圖8，K–M）。這些數(shù)據(jù)表明，Nedd4l在IECs中的缺失通過鐵死亡依賴的方式促進(jìn)了結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制。

為了進(jìn)一步評估Nedd4l缺陷小鼠與對照組相比加劇的結(jié)腸炎是否依賴于腸道微生物群，研究者在DSS給藥前兩周將Nedd4l缺陷小鼠與對照組小鼠同籠飼養(yǎng)。同籠飼養(yǎng)消除了Nedd4l缺陷小鼠與同籠飼養(yǎng)的對照組小鼠之間更嚴(yán)重的DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)展，表明NEDD4L以依賴腸道微生物群的方式保護(hù)小鼠免受結(jié)腸炎。為了揭示微生物群如何調(diào)節(jié)小鼠中的DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，研究者收集了經(jīng)DSS處理或未處理的Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠和對照組小鼠的糞便，并進(jìn)行了16S rDNA測序。與Nedd4lfl/fl小鼠相比，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠在DSS給藥后Akkermansia的豐度顯著增加，而Bifidobacterium和Lactobacillus的豐度顯著減少，未處理小鼠中豐度相似。作為重要的共生腸道細(xì)菌，Akkermansia、Bifidobacterium和Lactobacillus在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，Akkermansia的異常增加可能會促進(jìn)腸道黏蛋白的降解，從而加劇小鼠的結(jié)腸炎，這與研究者的表型一致，即Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠在DSS處理后腸道黏蛋白產(chǎn)生減少。為了進(jìn)一步研究腸道微生物群在NEDD4L調(diào)節(jié)的結(jié)腸炎中的作用，研究者在未經(jīng)處理和經(jīng)DSS處理的Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠和Nedd4lfl/fl小鼠中檢測了小腸的抗菌肽。Nedd4l缺陷最初在未經(jīng)DSS處理的小鼠中對抗菌肽表達(dá)沒有影響，例如血管生成素、Ang4；Defa-rs1和Defa20。DSS處理導(dǎo)致IECs損傷以及抗菌肽基因表達(dá)模式降低。此外，與Nedd4lfl/fl小鼠相比，Nedd4l在IECs中的缺陷顯著損害了Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的抗菌肽表達(dá)，表明IECs死亡等更強(qiáng)的影響在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中起著關(guān)鍵作用。因此，研究者將單籠飼養(yǎng)的Nedd4lfl/fl VillinCre和Nedd4lfl/fl小鼠在結(jié)腸炎誘導(dǎo)期間用Bifidobacterium和Lactobacillus進(jìn)行灌胃?？诜﨎ifidobacterium和Lactobacillus顯著限制了Nedd4lfl/fl VillinCre和Nedd4lfl/fl小鼠的結(jié)腸炎發(fā)展，表現(xiàn)為炎癥綜合征程度較低和黏液分泌能力較強(qiáng)，與未經(jīng)細(xì)菌灌胃的DSS處理的單籠飼養(yǎng)Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠相比，表明腸道微生物群參與了NEDD4L調(diào)節(jié)的結(jié)腸炎，特別是Bifidobacterium和Lactobacillus。從接受細(xì)菌灌胃的小鼠中分離的IEC樣本顯示，微生物群的管理顯著促進(jìn)了GPX4和SLC3A2的表達(dá)，但損害了TFRC的表達(dá)，從而消除了Nedd4lfl/fl VillinCre和Nedd4lfl/fl小鼠之間的信號差異，表明腸道微生物群通過GPX4在抑制鐵死亡中發(fā)揮了保護(hù)作用。

在小鼠中，廣泛使用了AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌（CAC）模型來研究炎癥相關(guān)性癌癥，因?yàn)檠装Y更嚴(yán)重的小鼠更有可能發(fā)展為結(jié)直腸癌（CRC）。因此，研究者進(jìn)一步探索了NEDD4L在CAC中的調(diào)節(jié)作用，使用了全身性Nedd4l缺陷小鼠和Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠。在體內(nèi)，磁共振成像（MRI）分析顯示，與WT小鼠相比，Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠在軸向和冠狀圖像中均顯示出結(jié)腸擴(kuò)張顯著增加，并且在第90天時(shí)Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的結(jié)腸中腫瘤數(shù)量更多（圖9A）。如圖9，A–D所示，Nedd4l缺陷小鼠更容易患癌。與它們的WT同窩小鼠相比，研究者在Nedd4l+/–和Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠的鄰近腫瘤和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了更高水平的Ki67+細(xì)胞（圖9，E和F），以及Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠腫瘤組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的增加（圖9G）。由于NEDD4L通過鐵死亡信號調(diào)節(jié)IECs炎癥，研究者假設(shè)NEDD4L可能通過鐵死亡信號調(diào)節(jié)CAC。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者在DSS處理期間腹腔注射鐵死亡抑制劑DFOM，以抑制炎癥反應(yīng)。如圖9，I–L所示，與ddH2O處理的對照小鼠相比，DFOM處理顯著抑制了AOM/DSS誘導(dǎo)的腫瘤形成和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在Nedd4lfl/fl VillinCre小鼠中的增加，并進(jìn)一步消除了Nedd4lfl/fl VillinCre和Nedd4lfl/fl小鼠之間的表型差異，表明NEDD4L通過鐵死亡信號調(diào)節(jié)CAC。

在結(jié)腸炎期間，脂質(zhì)過氧化促進(jìn)了CAC的發(fā)病機(jī)制，使結(jié)腸炎成為CRC的風(fēng)險(xiǎn)因素。接下來，研究者旨在探索在CAC期間NEDD4L基因或蛋白的變化。根據(jù)TCGA和GEO數(shù)據(jù)，與正常組織相比，CRC患者的腫瘤組織以及CAC小鼠的腫瘤組織中NEDD4L基因顯著下調(diào)。在AOM/DSS誘導(dǎo)期間，NEDD4L的表達(dá)動態(tài)變化。在AOM/DSS誘導(dǎo)后的第15天，NEDD4L基因和蛋白沒有顯著變化，但在第60天時(shí)，小鼠出現(xiàn)輕微的上皮增生/異型增生，NEDD4L略有下調(diào)。此外，在AOM/DSS誘導(dǎo)后的第90天，當(dāng)小鼠出現(xiàn)明顯的腫瘤形成時(shí)，NEDD4L基因和蛋白水平顯著下調(diào)（圖10，A–C）。在小鼠CAC誘導(dǎo)期間，NEDD4L蛋白表達(dá)與SLC3A2和GPX4顯著相關(guān)（圖10D）。使用CRC患者的結(jié)腸切片的組織芯片基礎(chǔ)IHC，研究者發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，CRC患者的結(jié)腸腫瘤組織中IECs的NEDD4L蛋白表達(dá)顯著受到抑制。同時(shí)，與正常組織相比，腫瘤和鄰近腫瘤組織中IECs的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物顯著增加（圖10，E和F），這與4-HNE促進(jìn)CRC發(fā)展的觀點(diǎn)一致。此外，CRC患者IECs中NEDD4L蛋白表達(dá)與SLC3A2和GPX4呈正相關(guān)（圖10，G和H）。一致地，研究者在GEPIA2數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)SLC3A2的基因表達(dá)與GPX4顯著相關(guān)，但與NEDD4L無關(guān)，表明NEDD4L對SLC3A2的后翻譯修飾。綜上所述，研究者的數(shù)據(jù)支持這樣一個(gè)觀點(diǎn)：在小鼠中，NEDD4L在AOM/DSS誘導(dǎo)的CRC發(fā)病機(jī)制中的保護(hù)作用依賴于其對SLC3A2/GPX4軸的調(diào)控。

NEDD4L在腸道上皮細(xì)胞中通過調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)蛋白（SLC3A2和GPX4）的表達(dá)，抑制IECs 的鐵死亡，從而維持腸道屏障的完整性，并在IBD和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。NEDD4L可能成為診斷和治療IBD及結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)，通過抑制鐵死亡來減輕腸道炎癥和腫瘤發(fā)生。

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Liang J, Wang N, Yao Y, Wang Y, An X, Wang H, Liu H, Jiang Y, Li H, Cheng X, Xu J, Liang X, Lou J, Xin Z, Zhang T, Wang X, Lin W. NEDD4L mediates intestinal epithelial cell ferroptosis to restrict inflammatory bowel diseases and colorectal tumorigenesis. J Clin Invest. 2024 Dec 17;135(3):e173994. doi: 10.1172/JCI173994. PMID: 39688910; PMCID: PMC11785928.