腎小管上皮細(xì)胞中的大自噬/自噬激活可防止急性腎損傷（AKI）。然而，免疫細(xì)胞自噬（如涉及巨噬細(xì)胞的自噬）在AKI 中的作用仍不清楚。在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞自噬是AKI 期間的一種適應(yīng)性反應(yīng)，因?yàn)樵?/span>LPS 或單側(cè)缺血再灌注誘導(dǎo)的AKI 期間，與WT 小鼠相比，巨噬細(xì)胞特異性自噬缺陷（atg5^-/-）小鼠表現(xiàn)出更高的血清肌酐、更嚴(yán)重的腎小管損傷、ADGRE1/F4/80+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加以及炎癥因子表達(dá)升高。在氯膦酸脂質(zhì)體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞耗竭小鼠中，采用轉(zhuǎn)移atg5^-/- 巨噬細(xì)胞（而非 WT 巨噬細(xì)胞）引起更嚴(yán)重的AKI 進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)。在體外也得到類(lèi)似的結(jié)果，即缺乏Atg5 的骨髓源巨噬細(xì)胞（BMDMs）對(duì)LPS 和IFNG 的反應(yīng)在很大程度上增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。機(jī)理上，Atg5基因缺失顯著上調(diào)TARM1（髓樣細(xì)胞上與T 細(xì)胞相互作用的活化受體1）的蛋白表達(dá)，而抑制TARM1 則抑制LPS 和IFNG 誘導(dǎo)的atg5^-/- RAW 264.7 巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。E3泛素連接酶MARCHF1和MARCHF8泛素化TARM1，并以自噬依賴(lài)的方式促進(jìn)其降解，而沉默或突變MARCHF1和MARCHF8的功能域則取消TARM1的降解。此外，泛素化的TARM1 從質(zhì)膜內(nèi)化到內(nèi)體，然后被泛素結(jié)合的自噬受體TAX1BP1 和SQSTM1 招募到自噬-溶酶體途徑中降解?？傊?，巨噬細(xì)胞自噬可通過(guò)MARCHF1和MARCHF8介導(dǎo)的TARM1降解抑制腎臟炎癥，從而預(yù)防AKI。該研究于2025年1月發(fā)表在《Autophagy》，IF：14.6。

作者首先研究了AKI患者和小鼠腎巨噬細(xì)胞中的自噬現(xiàn)象。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，在紅外誘導(dǎo)的 AKI（IR-AKI）小鼠的腎巨噬細(xì)胞中，Atg5、Atg7、Atg12、Lc3、Sqstm1、Lamp1 和 Lamp2 等自噬基因的表達(dá)量比在假小鼠腎巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量要高（圖 1A）。免疫熒光分析顯示，與極小變化腎病/MCN 患者相比，AKI 患者 CD68⁺ 巨噬細(xì)胞中 MAP1LC3/LC3（微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3）的表達(dá)升高（圖 1B）。這些數(shù)據(jù)表明，自噬是 AKI 期間腎巨噬細(xì)胞的一種適應(yīng)性反應(yīng)。

為監(jiān)測(cè)自噬通量，構(gòu)建巨噬細(xì)胞特異性串聯(lián)標(biāo)記的mCherry-EGFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠，當(dāng)游離自噬體與溶酶體因酸性而融合時(shí)，游離自噬體中的黃色熒光顆粒（mCherry-EGFP-LC3）會(huì)變成紅色熒光（mCherry-LC3），從而實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中自噬體動(dòng)態(tài)的可視化。免疫熒光分析顯示，與對(duì)照組小鼠相比，IR-AKI 和脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的敗血癥相關(guān)性 AKI（SA-AKI）小鼠腎臟 ADGRE1/F4/80⁺ 巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，自噬體（黃色點(diǎn)）和自溶酶體（僅紅色點(diǎn)）增加（圖 1C、D）。這些數(shù)據(jù)表明，在 AKI 進(jìn)展過(guò)程中，腎巨噬細(xì)胞中的自噬被激活。

為研究巨噬細(xì)胞自噬在AKI中的作用，將Lyz2（溶菌酶2）-Cre與Atg5^flox/+小鼠雜交，產(chǎn)生巨噬細(xì)胞自噬缺陷小鼠（atg5^-/-小鼠）和Atg5flox/flox（WT）對(duì)照小鼠。如圖 2A 所示，LPS（5 毫克/千克）處理后 12 小時(shí)，atg5^-/- 小鼠的死亡率為 50%，36 小時(shí)后增至 100%。相反，WT 小鼠表現(xiàn)出對(duì) LPS 的抵抗力，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間死亡率僅為五分之一。因此，將 LPS 的劑量降至 1 mg/kg（體重），以防止 atg5^-/- 小鼠死亡。與WT小鼠相比，atg5^-/-小鼠的血清肌酐（Scr）水平升高（圖2B）。此外，腎臟的病理?yè)p傷加劇，與WT小鼠相比，Atg5^-/-小鼠腎小管損傷的標(biāo)志物HAVCR1/KIM-1上調(diào)（圖2C-F）。因此，與WT小鼠相比，atg5^-/-小鼠發(fā)生更嚴(yán)重的SA-AKI。這些發(fā)現(xiàn)在IR-AKI中得到進(jìn)一步證實(shí)。此外，與 WT 小鼠相比，atg5^-/- 小鼠的腎小管損傷更嚴(yán)重，HAVCR1 表達(dá)更高（圖 2G-J）?？傊@些結(jié)果說(shuō)明巨噬細(xì)胞自噬可保護(hù)小鼠免受 LPS 和 IR 誘導(dǎo)的 AKI 的影響。

如圖 3A 和 B 所示，與患有 SA-AKI 的 WT 小鼠相比，atg5^-/- 小鼠腎組織中的 ADGRE1+ 巨噬細(xì)胞更為明顯。此外，在SA-AKI期間，與WT小鼠相比，atg5^-/-小鼠腎臟炎癥因子（包括CCL2/MCP-1、NLRP3和IL18）的表達(dá)明顯上調(diào)（圖3C、D）。與SA-AKI中的情況一樣，巨噬細(xì)胞中Atg5的缺失也會(huì)明顯增強(qiáng)ADGRE1+巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖3E、F）和atg5^-/-小鼠腎臟炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生（圖3G、H）。體外研究也證實(shí)類(lèi)似的結(jié)果，體外研究顯示，與WT BMDMs相比，LPS和IFNG刺激顯著增加atg5^-/-BMDMs中NOS2、NLRP3和IL18的蛋白水平（圖3I、J）。這些結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞自噬可抑制 AKI 中的腎臟炎癥。

在Lyz2-Cre下缺失Atg5不僅會(huì)破壞巨噬細(xì)胞的自噬，還會(huì)破壞中性粒細(xì)胞系的自噬，而中性粒細(xì)胞系也會(huì)導(dǎo)致AKI中的腎臟炎癥。為排除這種可能性，接下來(lái)利用過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)自噬是否能通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來(lái)減輕 AKI（圖 4A）?？肆_膦酸脂質(zhì)體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞消耗保護(hù)了SA-AKI 小鼠的腎損傷和炎癥反應(yīng)（圖 4B-D、J），證明巨噬細(xì)胞是驅(qū)動(dòng) AKI 的關(guān)鍵免疫細(xì)胞成分。此外，與 WT RAW 264.7 巨噬細(xì)胞相反，在接受 SA-AKI 的巨噬細(xì)胞缺失 WT 小鼠中，采納轉(zhuǎn)移 atg5^-/- RAW 264.7 巨噬細(xì)胞會(huì)明顯損害腎功能并加劇腎小管損傷（圖 4B-D）。同樣，與向巨噬細(xì)胞耗竭的 WT 或 atg5^-/-小鼠移入 WT BMDMs 相比，移入 atg5^-/- BMDMs 會(huì)顯著加重腎小管病變、上調(diào) HAVCR1 表達(dá)和升高血清肌酐（圖 4E-I）。此外，與接受 WT 巨噬細(xì)胞的小鼠相比，自噬缺陷巨噬細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移明顯增加巨噬細(xì)胞耗竭 WT 小鼠腎臟中這些炎癥分子的水平（圖 4J、K）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，自噬缺陷的巨噬細(xì)胞是導(dǎo)致 AKI 中腎小管過(guò)度損傷和腎臟炎癥的罪魁禍?zhǔn)住?/span>

為探索自噬抑制巨噬細(xì)胞促炎活性的機(jī)制，對(duì)受到LPS和IFNG刺激的WT小鼠和atg5^-/-小鼠的BMDMs進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示，分別有15個(gè)和10個(gè)蛋白質(zhì)被顯著上調(diào)和下調(diào)（|log2 fold|>2，p < 0.05）（圖5A）。其中，新發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體家族成員TARM1與WT BMDMs相比，在LPS和IFNG處理后在atg5^-/-BMDMs中明顯上調(diào)（圖5B，C）。此外，在 SA-AKI 期間，與 WT 小鼠相比，atg5^-/- 小鼠腎組織中的 TARM1 也明顯上調(diào)（圖 5D、E）。有趣的是，通過(guò) siRNA 或固定競(jìng)爭(zhēng)性 TARM1-FC 融合蛋白抑制 TARM1 能顯著抑制 LPS- 和 IFNG 誘導(dǎo)的 Atg5 缺陷 RAW 264.7 巨噬細(xì)胞中 NOS2 或 IL18 的表達(dá)（圖 5F-K）。這些結(jié)果表明，自噬缺陷誘導(dǎo)的TARM1通過(guò)SYK-NFKB信號(hào)通路激活促炎巨噬細(xì)胞。

自噬-溶酶體途徑和蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的兩個(gè)主要途徑，這一點(diǎn)已得到公認(rèn)。在本研究中，蛋白酶體抑制劑 MG132 處理 BMDMs 不會(huì)改變 TARM1 的表達(dá)（圖 6C，D）。相反，自噬激活劑 Rap 或 torin1 誘導(dǎo)的自噬下調(diào) BMDMs 中 TARM1 的表達(dá)；然而，CQ 或巴佛洛霉素 A1（Baf）抑制自噬增加 TARM1 的水平（圖 6E，F），這表明巨噬細(xì)胞 TARM1 是通過(guò)自噬-溶酶體途徑而不是蛋白酶體途徑降解的。

以前的研究表明，細(xì)胞膜受體在泛素化后被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)體，然后被分類(lèi)到溶酶體降解。然而，最近的研究表明，自噬參與膜受體的降解。在這里，作者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)刪除 Atg5 或用自噬抑制劑沃特曼寧（Wortmannin）和 LY294002 處理來(lái)抑制自噬體的形成，導(dǎo)致 TARM1 在 RAW 264.7 巨噬細(xì)胞中積累。同時(shí)抑制自噬體的形成和溶酶體的功能并不會(huì)導(dǎo)致 TARM1 表達(dá)的進(jìn)一步上調(diào)（圖 6G-J），這表明自噬體和溶酶體以相同的途徑降解巨噬細(xì)胞中的 TARM1。

泛素化是蛋白質(zhì)降解不可或缺的步驟。假設(shè)巨噬細(xì)胞的 TARM1 首先被 E3 泛素連接酶泛素化，如圖 7A 所述內(nèi)化到內(nèi)體，被 LC3 陽(yáng)性的自噬體吞噬進(jìn)入溶酶體降解。為解決這些假設(shè)，首先探討哪種 E3 泛素連接酶介導(dǎo) TARM1 泛素化，這是 TARM1 被自噬受體識(shí)別并轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬-溶酶體降解的關(guān)鍵修飾。利用在線(xiàn)工具 UbiBrowser 2.0 (http://ubibrowser.bio-it.cn/ubibrowser_v3/home/index)預(yù)測(cè)在人類(lèi)和小鼠中保守的 E3 泛素連接酶 MARCHF1、MARCHF8 和 SYTL4 可介導(dǎo) TARM1 泛素化（圖 7B）。用 TARM1-Flag 和空載體或 MARCHF1-MYC、MARCHF8-MYC 或 SYTL4-MYC 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞。強(qiáng)制表達(dá) MARCHF1 或 MARCHF8 以劑量依賴(lài)的方式降解 TARM1，而 SYTL4 的過(guò)表達(dá)不改變 TARM1 的水平（圖 7C）。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，CQ抑制MARCHF1和MARCHF8誘導(dǎo)的TARM1降解，而蛋白酶體抑制劑MG132沒(méi)有抑制這種降解（圖7D），這支持MARCHF1和MARCHF8通過(guò)自噬而不是蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白水解誘導(dǎo)TARM1降解。此外，共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，MARCHF1 和 MARCHF8 與 TARM1 相互作用并促進(jìn)其泛素化（圖 7E、F）。與此相反，當(dāng) MARCHF1 和 MARCHF8 的功能域發(fā)生突變時(shí)，它們?cè)?/span> TARM1 泛素化和降解中的功能喪失（圖 7G）。

最后，用shRNA 沉默MARCHF1 和MARCHF8 增加RAW 264.7 巨噬細(xì)胞中TARM1 的表達(dá)，同時(shí)增加NOS2 和IL18 的水平（圖8A-D）。相反，過(guò)表達(dá)MARCHF1 和MARCHF8 抑制TARM1，從而降低巨噬細(xì)胞中NOS2 和IL18 的水平（圖8E-H）?？傊?，這些結(jié)果表明，MARCHF1和MARCHF8 促進(jìn)自噬介導(dǎo)的TARM1 降解，從而抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

接下來(lái)，作者探討了泛素化是否是 TARM1 內(nèi)吞所必需的。 TARM1 的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)保守的賴(lài)氨酸殘基 K286 和 K293，它們是潛在的泛素化位點(diǎn)。因此，用精氨酸取代這兩個(gè)賴(lài)氨酸殘基，結(jié)果發(fā)現(xiàn) MARCHF1 和 MARCHF8 不能促進(jìn)突變 TARM1 的泛素化和降解（圖 9A）。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步表明，TARM1 在 RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)。然而，在 LPS 和 IFNG 的刺激下，K-to-R 突變的 TARM1 無(wú)法從質(zhì)膜內(nèi)化到內(nèi)體（圖 9B）。所有這些結(jié)果表明，TARM1泛素化是其內(nèi)吞不可或缺的條件。隨后，在 LPS 和 IFNG 的刺激下，轉(zhuǎn)染 TARM1[Mut]-His 的巨噬細(xì)胞與轉(zhuǎn)染WT TARM1 的巨噬細(xì)胞相比，NOS2、NLRP3 和 IL18 的表達(dá)量顯著增加（圖 9C，D）。值得注意的是，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了表面-TARM1 而不是細(xì)胞質(zhì)-TARM1 在介導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥中的關(guān)鍵作用。

公認(rèn)的選擇性自噬受體，如 SQSTM1、NBR1、OPTN（optineurin）、CALCOCO2/NDP52 和 TAX1BP1，可通過(guò) LC3 結(jié)合區(qū)/LIR 結(jié)構(gòu)域和 PB1 結(jié)構(gòu)域?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)移至自噬體和溶酶體。通過(guò)共免疫沉淀分析，TARM1 可與 TAX1BP1、SQSTM1 和 NBR1 相互作用（圖 10A），表明 TARM1 可被這些選擇性受體識(shí)別。此外，細(xì)胞免疫熒光數(shù)據(jù)顯示，LPS 和 IFNG 處理會(huì)引發(fā) TARM1 在細(xì)胞質(zhì)中聚集，并與轉(zhuǎn)染 TARM1-Flag 的 RAW 264.7 巨噬細(xì)胞中的選擇性自噬受體 TAX1BP1、SQSTM1 和 NBR1 共定位（圖 10B-E）。此外，在 RAW 264.7 巨噬細(xì)胞中，LPS 和 IFNG 也誘導(dǎo) TARM1 與 LC3 共定位。然而，與陰性對(duì)照（NC）相比，通過(guò) shRNA 沉默 TAX1BP1 或 SQSTM1 會(huì)減少 LPS 和 IFNG 刺激后 TARM1 與 LC3 的共定位，而沉默 NBR1 的影響較?。▓D 10F-J）。此外，Atg5的缺失也顯著增加TAX1BP1和SQSTM1的表達(dá)，表明TAX1BP1和SQSTM1可能是巨噬細(xì)胞中TARM1的主要受體（圖5A）。此外，如圖 10K 所示，自噬受體 TAX1BP1 和 SQSTM1 與泛素化 TARM1 的親和分離分析表明，泛素化 TARM1 與自噬受體 TAX1BP1 和 SQSTM1 結(jié)合。這些結(jié)果表明，泛素化的 TARM1 內(nèi)化為內(nèi)體，隨后被細(xì)胞質(zhì)中的自噬受體 TAX1BP1 和 SQSTM1 識(shí)別，然后被 LC3 陽(yáng)性吞噬細(xì)胞吞噬并與溶酶體融合降解。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞自噬是對(duì) AKI 的一種適應(yīng)性反應(yīng)。在 AKI 小鼠模型中，巨噬細(xì)胞自噬功能缺失的小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的腎損傷和炎癥。巨噬細(xì)胞中缺乏自噬相關(guān)基因 Atg5 導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子的高表達(dá)。此外，巨噬細(xì)胞中缺失 Atg5 增加 TARM1 蛋白，而 TARM1 蛋白受 E3 泛素連接酶 MARCHF1 和 MARCHF8 的調(diào)控，促進(jìn)其通過(guò)自噬降解。這一過(guò)程涉及 TARM1 的內(nèi)化和被 SQSTM1 和 TAX1BP1 等自噬受體招募到溶酶體（圖 11）?？傊?，巨噬細(xì)胞自噬可通過(guò)降解 TARM1 減少炎癥反應(yīng)，從而緩解 AKI，為腎臟疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。

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Huang XR, Ye L, An N, Wu CY, Wu HL, Li HY, Huang YH, Ye QR, Liu MD, Yang LW, Liu JX, Tang JX, Pan QJ, Wang P, Sun L, Xia Y, Lan HY, Yang C, Liu HF. Macrophage autophagy protects against acute kidney injury by inhibiting renal inflammation through the degradation of TARM1. Autophagy. 2025 Jan;21(1):120-140. doi: 10.1080/15548627.2024.2393926. Epub 2024 Sep 8. PMID: 39193910; PMCID: PMC11702950.