胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是一種致命的惡性腫瘤，其特征是早期轉(zhuǎn)移、對(duì)傳統(tǒng)療法的耐藥性以及預(yù)后極差。盡管在理解PDAC的遺傳學(xué)、識(shí)別轉(zhuǎn)錄亞型以及對(duì)其腫瘤微環(huán)境的深入了解方面取得了顯著進(jìn)展，但仍缺乏有效的治療方法。目前該病的治療主要依賴于傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性療法，這種療法易對(duì)患者產(chǎn)生不良影響。在本研究中，作者對(duì)PDAC的超級(jí)增強(qiáng)子（SE）景觀進(jìn)行了表征，以識(shí)別可能具有靶向性的疾病驅(qū)動(dòng)因素。分析結(jié)果顯示MICAL2作為PDAC超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)基因，能夠編碼黃素單加氧酶MICAL2，該酶誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白解聚，并通過調(diào)節(jié)血清反應(yīng)因子共激活因子（MRTF-A和MRTF-B）的可用性，間接促進(jìn)SRF轉(zhuǎn)錄。MICAL2在PDAC中過表達(dá)，且高MICAL2表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)。轉(zhuǎn)錄分析顯示，MICAL2上調(diào)KRAS和EMT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。在人和小鼠PDAC細(xì)胞中MICAL2功能喪失和獲得實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)MICAL2促進(jìn)了ERK1/2和AKT的激活，并促進(jìn)了體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。有趣的是，作者還發(fā)現(xiàn)由MRTF-B而不是MRTF-A在體內(nèi)模仿了MICAL2驅(qū)動(dòng)的表型?？傊?，作者的這項(xiàng)研究突出了MICAL2影響PDAC的多種機(jī)制，并為未來研究靶向MICAL2的干預(yù)治療提供了理論基礎(chǔ)。該研究于2025年1月發(fā)表在《Cancer Research》，IF 14.2分。

作者從接受PDAC手術(shù)切除的患者中獲取了腫瘤樣本（n = 7），以及接受非腺癌組織切除的患者的正常胰腺組織樣本（n = 6）。將這些組織樣本進(jìn)行裂解，并進(jìn)行了組蛋白3賴氨酸27乙?；?/span>H3K27ac）的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq），以識(shí)別人類PDAC中的活躍轉(zhuǎn)錄區(qū)域。作者通過計(jì)算方法識(shí)別了正常和腫瘤樣本中的超級(jí)增強(qiáng)子（SE）區(qū)域和SE相關(guān)基因（圖1A）。在腫瘤樣本中，富集程度最高的SE相關(guān)基因包括DAD1、MBP（與神經(jīng)周圍侵襲相關(guān)）；LIMK2、MSN、CAPZB（與細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)相關(guān)）；FCGR3A、FCGR2A、RUNX1（與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)）。正常胰腺組織中富集的SE相關(guān)基因包括CEL和PLA2G1B（與胰腺外分泌功能相關(guān)）。

接下來，作者試圖識(shí)別在PDAC中上調(diào)的基因，這些基因編碼的蛋白質(zhì)有可能被小分子或抗體基礎(chǔ)的治療藥物所靶向。與正常組織相比，MICAL2在腫瘤樣本中顯著富集（Log2變化倍數(shù)為1.07；調(diào)整后的p值為5.39×10^-4）（圖1A）。此外，定量PCR（qPCR）分析顯示，MICAL2 mRNA在腫瘤樣本中富集（p值為0.009），這表明在啟動(dòng)子和編碼區(qū)域增加的H3K27ac信號(hào)確實(shí)導(dǎo)致了MICAL2位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄激活增加（圖1B、1C）。為了確定MICAL2轉(zhuǎn)錄水平的提高是否導(dǎo)致PDAC腫瘤中MICAL2蛋白水平的增加，作者對(duì)人類正常胰腺和PDAC組織進(jìn)行了免疫組化（IHC）染色。作者發(fā)現(xiàn)在4例患者腫瘤中MICAL2染色呈現(xiàn)出顯著的腫瘤特異性增加（圖2A）。接下來，作者觀察到在常用的KrasLSL-G12D；TP53LSL-R172H；以及PDX1-cre（KPC）基因工程小鼠模型中，高MICAL2蛋白水平和腫瘤特異性得以保持（圖2B）。作者研究了MICAL2表達(dá)與接受手術(shù)切除的PDAC患者（PanCuRx）以及晚期疾病患者（COMPASS）的預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。作者發(fā)現(xiàn)，在手術(shù)隊(duì)列中，高MICAL2表達(dá)與更差的預(yù)后相關(guān)，但在晚期隊(duì)列中并非預(yù)后因素（圖2C-D）。這表明MICAL2可能在原發(fā)性到晚期疾病的進(jìn)展中發(fā)揮作用?？傮w而言，作者發(fā)現(xiàn)PDAC具有與已知PDAC生物學(xué)相關(guān)的獨(dú)特SE相關(guān)基因景觀。作者在這些基因中發(fā)現(xiàn)了MICAL2，并確定與正常鄰近組織相比，PDAC中的MICAL2轉(zhuǎn)錄水平更高，這在作者的研究以及其他獨(dú)立數(shù)據(jù)集中都得到了證實(shí)，并且與蛋白水平的增加表達(dá)相關(guān)。重要的是，高MICAL2表達(dá)與手術(shù)切除腫瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)，表明高表達(dá)MICAL2可能標(biāo)記著復(fù)發(fā)和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)增加的腫瘤。

在上皮細(xì)胞中，作者發(fā)現(xiàn)MICAL2基因座上游存在416個(gè)假定的超級(jí)增強(qiáng)子（SE）區(qū)域。為了確定MICAL2轉(zhuǎn)錄水平的提高是否導(dǎo)致PDAC腫瘤中MICAL2蛋白水平的增加，作者對(duì)人類正常胰腺和PDAC組織進(jìn)行了免疫組化（IHC）檢測。在4例患者腫瘤中，MICAL2染色呈現(xiàn)出顯著的腫瘤特異性增加（圖2A）。

接下來，作者觀察到在常用的KrasLSL-G12D，TP53LSL-R172H和PDX1-cre（KPC）基因工程小鼠模型中，高MICAL2蛋白水平和腫瘤特異性得以保留（圖2B）。在手術(shù)隊(duì)列中，高MICAL2表達(dá)與更差的預(yù)后相關(guān)，但在晚期隊(duì)列中并不具有預(yù)后價(jià)值（圖2C-D）。這表明MICAL2可能在原發(fā)疾病向晚期疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用。

總體而言，作者的數(shù)據(jù)表明PDAC具有與已知PDAC生物學(xué)相關(guān)的獨(dú)特SE相關(guān)基因景觀。作者在這些基因中發(fā)現(xiàn)了MICAL2，并確定與正常鄰近組織相比，PDAC中MICAL2的轉(zhuǎn)錄水平更高，這在作者的研究以及其他獨(dú)立數(shù)據(jù)集中均有所體現(xiàn)，并且與蛋白水平的增加表達(dá)相關(guān)。重要的是，高MICAL2表達(dá)與手術(shù)切除腫瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)，表明高表達(dá)MICAL2可能標(biāo)記著復(fù)發(fā)和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)增加的腫瘤。

作者發(fā)現(xiàn)，在MICAL2基因敲低（KD）細(xì)胞中，額外的促生存途徑喪失，例如TNFα和HIF1α信號(hào)通路，這表明MICAL2可能在胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）中作為原癌基因發(fā)揮作用。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)EMT信號(hào)通路在MICAL2 KD細(xì)胞中也顯著減少（圖3A）。作者利用Der實(shí)驗(yàn)室最近發(fā)表的一項(xiàng)研究，該研究全面分析了KRAS依賴的轉(zhuǎn)錄程序，并發(fā)現(xiàn)沉默MICAL2后，KRAS調(diào)控的基因進(jìn)一步下調(diào)，這表明MICAL2調(diào)節(jié)KRAS信號(hào)通路（圖3B）。作為一種正交途徑分析方法，作者通過OncoGPS方法識(shí)別了與MICAL2表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞狀態(tài)，這些細(xì)胞狀態(tài)是通過KRAS激活的下游轉(zhuǎn)錄活性在癌癥細(xì)胞系百科全書（CCLE）的其他腫瘤模型中闡明的。與GSEA類似，作者發(fā)現(xiàn)EMT狀態(tài)與CCLE中更高的MICAL2基因表達(dá)相關(guān)（圖3C）。為了進(jìn)一步研究EMT表型，作者使用了一種源自KPC肝轉(zhuǎn)移的PDAC類器官系KPC46，該類器官具有間充質(zhì)特征和高轉(zhuǎn)移傾向（圖3D）。在MICAL2 KD細(xì)胞中，作者觀察到間充質(zhì)到上皮的轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為高度均勻、極化、緊湊的上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，表達(dá)增加的E-鈣粘蛋白（圖3E）?？傮w而言，這些實(shí)驗(yàn)揭示了MICAL2在人類和小鼠PDAC模型中驅(qū)動(dòng)MRTF/SRF轉(zhuǎn)錄、EMT和促癌途徑。

作者的轉(zhuǎn)錄組分析表明，MICAL2缺失的PDAC細(xì)胞中KRAS信號(hào)通路發(fā)生了改變。因此，作者評(píng)估了在MICAL2功能喪失和獲得的細(xì)胞中KRAS效應(yīng)通路PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)的激活情況。由于MICAL2的缺失導(dǎo)致SRF共激活因子MRTF-A和MRTF-B的表達(dá)發(fā)生改變，作者還研究了這兩個(gè)基因敲低（KD）的效果。在人類PDAC細(xì)胞系AsPC1中，MICAL2的缺失導(dǎo)致p-AKT顯著減少，而p-ERK1/2沒有變化（圖3F）。負(fù)性細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子P27在MICAL2敲低細(xì)胞中顯著增加，這表明MICAL2可能通過這種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。通過siRNA介導(dǎo)的MRTF-B沉默模擬了MICAL2沉默細(xì)胞中觀察到的p-AKT減少現(xiàn)象。有趣的是，MRTF-A的缺失并未重現(xiàn)這一表型，且MRTFs的功能喪失并未模擬P27的增加。

接下來，作者在KPC46細(xì)胞中評(píng)估了MICAL2和MRTFs的缺失。作者發(fā)現(xiàn)，小鼠PDAC細(xì)胞在MICAL2和MRTF-B沉默的細(xì)胞中重現(xiàn)了p-AKT和p-ERK1/2的減少，然而，這一細(xì)胞系中P27未發(fā)生變化（圖3G）。這些結(jié)果表明，MICAL2和MRTF-B缺失的細(xì)胞中PI3K和MAPK的磷酸化減少，與KRAS信號(hào)減弱一致。當(dāng)作者檢查經(jīng)過改造以表達(dá)MICAL2的BxPc3細(xì)胞時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)p-AKT和P27的表達(dá)顯著增加（圖3H）。為了直接確定MICAL2表達(dá)是否改變了KRAS信號(hào)，作者在BxPc3細(xì)胞中過表達(dá)MICAL2后對(duì)KRAS-GTP裝載進(jìn)行了表征。作者發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞中KRAS-GTP裝載水平顯著增加，從而直接將MICAL2表達(dá)與KRAS活性聯(lián)系起來（圖3I）。

為了進(jìn)一步評(píng)估MICAL2對(duì)KRAS信號(hào)通路的影響，作者考察了MICAL2基因敲低（KD）對(duì)巨胞飲作用的影響，這是一種由KRAS驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞外營養(yǎng)物質(zhì)攝取過程。作者觀察到MICAL2缺失細(xì)胞中巨胞飲作用顯著減少，這與KRAS信號(hào)活性的降低一致（圖3J）。綜上所述，功能喪失和功能獲得研究揭示了MICAL2通過KRAS促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)，表現(xiàn)為KRAS-GTP結(jié)合、MAPK和PI3K的磷酸化以及巨胞飲作用。盡管存在模型間的差異，這些觀察到的生化結(jié)果與作者對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的通路分析一致。

作者為了探究MICAL2功能喪失和功能獲得對(duì)PDAC細(xì)胞癌性表型的影響。鑒于MICAL2似乎驅(qū)動(dòng)EMT過程，作者首先測量了MICAL2、MRTF-A和MRTF-B缺失細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。作者發(fā)現(xiàn)，在ASPC1和KPC46細(xì)胞中，MICAL2敲低（KD）后遷移能力均有所降低（圖4A，B）。作者還發(fā)現(xiàn)，人類ASPC1細(xì)胞中MRTF-A和MRTF-B的敲低減少了細(xì)胞遷移，而在小鼠KPC46細(xì)胞中，僅MRTF-A的敲低導(dǎo)致遷移能力下降。相反，在功能獲得實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)MICAL2的BxPc3細(xì)胞相比空載體對(duì)照細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的遷移能力（圖4C）。

隨后，作者評(píng)估了MICAL2對(duì)細(xì)胞增殖的影響。作者發(fā)現(xiàn)，MICAL2基因敲低（KD）導(dǎo)致ASPC1和KPC46細(xì)胞的增殖顯著減少，而BxPc3細(xì)胞中MICAL2的過表達(dá)（OE）則使增殖率相較于對(duì)照細(xì)胞有所增加（圖4D-F）。有趣的是，無論是人類還是小鼠的PDAC細(xì)胞中，任一MRTF的敲低僅導(dǎo)致細(xì)胞增殖率的部分下降（圖4D-E）。為了更好地了解MICAL2表達(dá)影響細(xì)胞周期的哪一部分，作者使用流式細(xì)胞術(shù)來檢測細(xì)胞周期進(jìn)程。在ASPC1和KPC46細(xì)胞中，MICAL2和MRTF-B缺失的細(xì)胞顯著傾向于G0/G1期的停滯，并且S期和G2/M期的細(xì)胞比例相應(yīng)減少（圖4G和H）。缺乏MRTF-A的KPC46細(xì)胞在細(xì)胞周期輪廓上沒有變化，但缺乏MRTF-A的ASPC1細(xì)胞卻意外地在S期出現(xiàn)阻滯，而非G0/G1期，這暗示了不同模型之間以及人類與小鼠PDAC細(xì)胞之間可能存在的差異。相反，過表達(dá)MICAL2的BxPc3細(xì)胞更快地通過G0/G1期，并且相較于對(duì)照組，S期的細(xì)胞比例增加，表明MICAL2表達(dá)的增加足以促進(jìn)細(xì)胞分裂（圖4I）?？傮w而言，這些實(shí)驗(yàn)表明MICAL2和MRTF-A/B的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。此外，這些發(fā)現(xiàn)與作者在PDAC細(xì)胞中基因敲低MICAL2后觀察到的RNA測序和生化結(jié)果一致。

作者通過體外沉默MICAL2，觀察到細(xì)胞增殖、遷移、侵襲減少，以及EMT表型的逆轉(zhuǎn)。因此，作者接下來旨在確定MICAL2和MRTFs的缺失如何影響腫瘤形成，最初使用異位皮下小鼠移植模型。作者首先將具有MICAL2或MRTF-A/B組成性敲低的AsPC1細(xì)胞移植到免疫缺陷的NSG小鼠中。作者觀察到，當(dāng)MICAL2和MRTF-B缺失時(shí)，腫瘤大小顯著減少，但MRTF-A沉默后沒有顯著差異（圖5A）。在同種小鼠中移植KPC46細(xì)胞重現(xiàn)了人類PDAC細(xì)胞觀察到的結(jié)果，盡管腫瘤形成減少更為顯著（圖5B）。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，MICAL敲低細(xì)胞未形成腫瘤，而在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，6個(gè)中有1個(gè)腫瘤未形成，其余腫瘤相對(duì)于對(duì)照組顯著生長抑制。相反，當(dāng)注射到NSG動(dòng)物的側(cè)腹時(shí)，過表達(dá)MICAL2的BxPc3細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞生長得更大（圖5C）。為了確定MICAL2敲低細(xì)胞生長減少是否由于植入失敗，作者建立了用shRNA靶向MICAL2（ish-MICAL2）或?qū)φ眨?/span>ish-control）的強(qiáng)力霉素（dox）誘導(dǎo)型KPC46細(xì)胞。作者將細(xì)胞植入同種動(dòng)物的側(cè)腹，并在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)前讓腫瘤形成10天，通過觸診和超聲波記錄。在用強(qiáng)力霉素處理的ish-MICAL2植入小鼠中，與ish-control相比，44天內(nèi)的腫瘤生長被抑制，但在未用強(qiáng)力霉素處理的常規(guī)飲食小鼠中則沒有（圖5D-E）。作者通過將細(xì)胞植入胰尾來研究MICAL2和MRTFs如何影響原位腫瘤生長。作者發(fā)現(xiàn)，只有植入AsPC1 MICAL2-KD細(xì)胞的小鼠，而非MRTF-KDs，有顯著減少的腫瘤負(fù)荷，而在KPC46模型中，與scramble對(duì)照相比，MICAL2和MRTF-B沉默的細(xì)胞在體內(nèi)生長減少（圖5F-G）?？傊?，PDAC細(xì)胞中MICAL2和MRTF-B的表達(dá)促進(jìn)了異位和原位的腫瘤生長，而MRTF-A的表達(dá)對(duì)腫瘤生長沒有影響。這些結(jié)果與作者體外發(fā)現(xiàn)MICAL2促進(jìn)PDAC細(xì)胞增殖的發(fā)現(xiàn)一致，并表明MRTF-A和-B在促進(jìn)胰腺腫瘤生長中扮演不同的角色。

為了確定MICAL2和MRTFs表達(dá)如何影響PDAC細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肝臟的能力，作者將PDAC細(xì)胞注射到小鼠的脾臟中。作者首先注射了MICAL2、MRTF-A和MRTF-B敲低的KPC46細(xì)胞（圖6A）。從宏觀上看，作者觀察到在MICAL2、MRTF-A和MRTF-B敲低模型中，肝臟轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)顯著減少，與對(duì)照細(xì)胞相比。從組織學(xué)上看，作者發(fā)現(xiàn)與對(duì)照細(xì)胞注射時(shí)廣泛的轉(zhuǎn)移性疾病相比，敲低模型中只有小的、通常僅在顯微鏡下可檢測到的肝臟轉(zhuǎn)移。為了確定dox誘導(dǎo)的MICAL2敲低細(xì)胞的植入是否導(dǎo)致這種表型，作者將ish-MICAL2或ish-對(duì)照KPC46細(xì)胞注射到同種小鼠的脾臟中，并在注射后第3天給小鼠提供dox。在這個(gè)模型中，作者發(fā)現(xiàn)ish-MICAL2組在宏觀和組織學(xué)上的轉(zhuǎn)移顯著減少。最后，作者將過表達(dá)MICAL2或載體對(duì)照的BxPc3細(xì)胞注射到NSG小鼠的脾臟中。這些結(jié)果表明MICAL2、MRTF-A和B促進(jìn)PDAC細(xì)胞的肝臟轉(zhuǎn)移

綜上所述，作者研究了PDAC的表觀基因組圖譜，識(shí)別出MICAL2作為一個(gè)獨(dú)特的PDAC進(jìn)展驅(qū)動(dòng)因子，通過其對(duì)MRTF/SRF信號(hào)通路的調(diào)控。作者還確定了MRTF-A與MRTF-B在促進(jìn)PDAC生長中的不同效應(yīng)。鑒于MICAL2和MRTF-SRF生物學(xué)在調(diào)控其腫瘤生物學(xué)基本轉(zhuǎn)錄程序中的作用，它們代表了PDAC治療中具有吸引力的、新的且可能易于處理的靶點(diǎn)。

ChIP-seq數(shù)據(jù)分析、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析、基因集富集分析、ChIP-seq、RNA-seq、qPCR、IHC、Western Blot、Co-IP、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、皮下移植實(shí)驗(yàn)、原位移植實(shí)驗(yàn)、脾臟注射模型、組織學(xué)分析

Garg B, Khan S, Courelli AS, Panneerpandian P, Sheik Pran Babu D, Mose ES, Gulay KCM, Sharma S, Sood D, Wenzel AT, Martsinkovskiy A, Rajbhandari N, Patel J, Jaquish D, Esparza E, Jaque K, Aggarwal N, Lambies G, D'Ippolito A, Austgen K, Johnston B, Orlando DA, Jang GH, Gallinger S, Goodfellow E, Brodt P, Commisso C, Tamayo P, Mesirov JP, Tiriac H, Lowy AM. MICAL2 Promotes Pancreatic Cancer Growth and Metastasis. Cancer Res. 2025 Jan 2. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-24-0744. Epub ahead of print. PMID: 39745352.