在感染或癌癥進(jìn)展過(guò)程中，初始的CD8+ T細(xì)胞在抗原識(shí)別后被激活并克隆擴(kuò)增，逐漸分化為細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞和少量記憶細(xì)胞。然而，癌癥進(jìn)展時(shí)，腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞與腫瘤共存；腫瘤微環(huán)境中持續(xù)的抗原暴露驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞抗原受體（TCR）的慢性信號(hào)傳導(dǎo)，破壞記憶T細(xì)胞（TM）向功能耗竭狀態(tài)的分化，最終促進(jìn)免疫逃逸。耗竭性T細(xì)胞（TEX）在腫瘤中表達(dá)高水平抑制性受體、細(xì)胞毒性功能受損、增殖能力降低，通常預(yù)示著免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）療法和過(guò)繼細(xì)胞免疫療法的臨床結(jié)果不佳。CD8+ T細(xì)胞耗竭是抗腫瘤免疫的一個(gè)關(guān)鍵障礙，該文章通過(guò)泛癌scRNA-seq聯(lián)合scATAC-seq篩選與CD8+ T耗竭相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，尋找有望成為改善癌癥免疫治療效果的潛在靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。該文章于2025年1月13日發(fā)表在《Nature Cancer》，IF=23.5。

技術(shù)路線：

研究結(jié)果：

1. ETV7是決定CD8+T細(xì)胞耗竭的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子

為了系統(tǒng)性研究與 CD8+ T 細(xì)胞記憶和耗竭狀態(tài)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（TFs），研究者分析了來(lái)自 21 種癌癥類型、316 名患者的 CD8+ T 細(xì)胞的泛癌單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)集（圖 1a），并結(jié)合單細(xì)胞 ATAC-seq 數(shù)據(jù)集（來(lái)自腎細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌的 CD8+ T 細(xì)胞），進(jìn)一步篩選出結(jié)合基序富集在記憶和耗竭基因差異可及性區(qū)域的 TFs（圖 1a、b）。綜合篩選結(jié)果，研究者確定了 13 個(gè)可能驅(qū)動(dòng) T 細(xì)胞向終末耗竭分化的TFs（BATF、IKZF3、ETV7、ZBED2、BACH1、VDR、ZNF282、PRDM5、ZBTB32、NR5A2、RUNX2、KLF7 和 PRDM1）。對(duì)排名前五的 TFs（BATF、IKZF3、ETV7、ZBED2 和 BACH1）進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證（圖 1c、d），它們?cè)诤慕咝?T 細(xì)胞（TEX）中上調(diào)，并與記憶和耗竭基因的表達(dá)相關(guān)（圖 1d、e）。研究者還開(kāi)發(fā)了一種體外終末分化模型，通過(guò)持續(xù)的抗 CD3 和抗 CD28 刺激誘導(dǎo)慢性 TCR 信號(hào)傳導(dǎo)，以篩選控制 T 細(xì)胞終末分化的TFs（圖 1f）。與終末表型相比，記憶基因表達(dá)降低，而耗竭基因表達(dá)增加。在分化過(guò)程中，BATF、IKZF3 和 ETV7 的表達(dá)逐漸上調(diào)，其中 ETV7 的上調(diào)最為顯著，而 ZBED2 和 BACH1 的表達(dá)則隨著分化而下降?；谂R床單細(xì)胞分析和體外驗(yàn)證結(jié)果，ETV7 被確定為調(diào)節(jié) CD8+ T 細(xì)胞從記憶向耗竭分化的關(guān)鍵 TF。

如果ETV7對(duì)決定T細(xì)胞終末衰竭的命運(yùn)至關(guān)重要，那么它的表達(dá)必然與衰竭有關(guān)。作者首先檢測(cè)了基底細(xì)胞癌和黑色素瘤的腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞中ETV7的染色質(zhì)可及性。在終末分化軌跡中，ETV7的染色質(zhì)狀態(tài)逐漸開(kāi)放，尤其是在終末耗竭階段。與染色質(zhì)狀態(tài)分析結(jié)果一致，通過(guò)對(duì)泛癌scRNA-seq數(shù)據(jù)集的CD8+ T細(xì)胞元簇進(jìn)行均勻流形近似與投影可視化分析（UMAP），研究者發(fā)現(xiàn)ETV7表達(dá)細(xì)胞（ETV7+）在耗竭性T細(xì)胞（TEX）群體中富集。此外，在泛癌scRNA-seq數(shù)據(jù)集中，ETV7+細(xì)胞在分化過(guò)程中更多地富集于TEX細(xì)胞而非記憶性T細(xì)胞（TM）。ETV7在TEX細(xì)胞中高表達(dá)，類似于其他耗竭標(biāo)記基因，而在表達(dá)高水平記憶標(biāo)記基因的TM細(xì)胞中低表達(dá)。此外，ETV7+細(xì)胞在TEX細(xì)胞群體中的頻率顯著高于TM細(xì)胞。進(jìn)一步分析顯示，在泛癌研究以及特定癌癥類型（如食管癌和子宮內(nèi)膜癌）中，ETV7表達(dá)水平與記憶評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與耗竭評(píng)分呈正相關(guān)，表明高ETV7表達(dá)與記憶狀態(tài)向耗竭狀態(tài)的終末分化相關(guān)。

圖1 單細(xì)胞分析和體外篩選的結(jié)合鑒定出ETV7是一個(gè)關(guān)鍵的TF，可以將腫瘤浸潤(rùn)性CD8+ T細(xì)胞的分化從記憶狀態(tài)轉(zhuǎn)移到耗盡狀態(tài)

圖2 在不同癌癥個(gè)體中CD8+ T細(xì)胞從記憶到衰竭的分化過(guò)程中，ETV7表達(dá)增加

2. ETV7在CD8+T細(xì)胞從記憶到耗竭分化過(guò)程中表達(dá)增加

通過(guò)比較人類scRNA-seq數(shù)據(jù)中ETV7+和ETV7?T細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因，研究者發(fā)現(xiàn)ETV7+細(xì)胞中上調(diào)的基因在IFN相關(guān)通路中顯著富集（圖2i），ETV7表達(dá)與ISG評(píng)分呈正相關(guān)（圖2j）。這一發(fā)現(xiàn)與長(zhǎng)期暴露于I型IFN促進(jìn)慢性感染和癌癥中CD8+T細(xì)胞耗竭的觀點(diǎn)一致。研究者因此假設(shè)IFNs可能上調(diào)CD8+T細(xì)胞中的ETV7表達(dá)。在所有類型的IFNs中，只有IFNβ顯著增加了ETV7表達(dá)。此外，IFNβ處理以時(shí)間和濃度依賴性方式增加了ETV7的mRNA和蛋白水平。在人類原代CD8+T細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果（圖2k、l）。TCR激活是T細(xì)胞分化的基礎(chǔ)。與ETV7表達(dá)在TEX細(xì)胞中富集的觀察結(jié)果一致（圖2c-h），長(zhǎng)時(shí)間的TCR刺激（超過(guò)24h）顯示出預(yù)期的但較弱的ETV7表達(dá)上調(diào)。值得注意的是，與IFNβ相比，TCR激活對(duì)ETV7表達(dá)的影響較弱且延遲，而IFNβ在24h時(shí)就顯示出顯著且持續(xù)的強(qiáng)效作用。這些結(jié)果表明，IFNβ可能是調(diào)節(jié)ETV7的主要因素。總之，ETV7由IFN信號(hào)誘導(dǎo)，標(biāo)志著CD8+T細(xì)胞從記憶細(xì)胞（TM）向終末耗竭細(xì)胞（TEX）的終末分化。

3. ETV7使CD8+T細(xì)胞分化偏向耗竭

ETV7屬于E26轉(zhuǎn)化特異性（ETS）家族的轉(zhuǎn)錄因子，盡管ETV7在脊椎動(dòng)物中高度保守，但它在小鼠中缺失。為了研究ETV7是否參與T細(xì)胞從記憶向終末耗竭的分化，研究者通過(guò)CRISPR-Cas9和過(guò)表達(dá)方法操縱ETV7的表達(dá)（圖3a）。在人類CD8+T細(xì)胞中，ETV7的引入抑制了記憶分化關(guān)鍵基因的表達(dá)（圖3b），并增加了耗竭基因的表達(dá)（圖3c）。相反，使用gRNA敲除ETV7可提高記憶基因的表達(dá)并抑制耗竭基因的表達(dá)（圖3b、c）。在小鼠CD8+T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)以及在人類CD8+T細(xì)胞中敲低ETV7也獲得了類似的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)與基于人類scRNA-seq數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析一致（圖2）。研究者進(jìn)一步研究了ETV7在急性感染和慢性感染病理?xiàng)l件下的T細(xì)胞分化效應(yīng)。為了模擬急性細(xì)菌感染，研究者使用了OT-I小鼠（攜帶識(shí)別卵清蛋白（OVA）肽殘基257-264表位（OVA257-264）的轉(zhuǎn)基因TCR）。將表達(dá)ETV7或載體對(duì)照的OT-ICD8+T細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射到CD45.1小鼠中，隨后用Lm-OVA感染。ETV7抑制了記憶標(biāo)記的表達(dá)，并在感染后第3天顯著增加了耗竭標(biāo)記的表達(dá)。與之前報(bào)道一致，記憶和耗竭標(biāo)記在感染后第3天表達(dá)，并在第8天逐漸降至基線水平，隨后在TM細(xì)胞中保持低水平。如預(yù)期所示，研究者觀察到ETV7+OT-I細(xì)胞在脾臟中的數(shù)量少于對(duì)照細(xì)胞。研究者還使用P14小鼠作為急性病毒感染模型，用LCMVArmstrong感染P14小鼠。將LCMV糖蛋白33-41（GP33）激活的CD8+T細(xì)胞從P14小鼠中富集出來(lái)，然后將表達(dá)ETV7或載體對(duì)照的CD45.1P14CD8+T細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射到CD45.2小鼠中，隨后用LCMVArmstrong感染。記憶和耗竭標(biāo)記在LCMVArmstrong感染后第3天表達(dá)，并在第8天降至基線水平。值得注意的是，ETV7的引入減少了記憶標(biāo)記的表達(dá)，并顯著增加了耗竭標(biāo)記的表達(dá)，尤其是在感染后第3天。此外，ETV7表達(dá)顯著減少了預(yù)耗竭T細(xì)胞（TCF1+TIM3?）的數(shù)量，并增加了TEX（TCF1?TIM3+）細(xì)胞的數(shù)量。研究者進(jìn)一步測(cè)試了病毒特異性CD8+T細(xì)胞（GP33特異性CD8+T細(xì)胞）的動(dòng)態(tài)和功能。在病毒感染過(guò)程中，CD8+T細(xì)胞經(jīng)歷了一個(gè)復(fù)雜的分化過(guò)程，包括初始激活和擴(kuò)增、死亡以及TM細(xì)胞（病毒特異性）的形成。與之前報(bào)道一致，研究者觀察到在初始擴(kuò)增后，GP33特異性P14CD8+T細(xì)胞的數(shù)量急劇下降。相比之下，ETV7表達(dá)顯著減少了病毒特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，削弱了這一特征表型。此外，ETV7表達(dá)顯著抑制了四聚體+細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。因此，根據(jù)病毒動(dòng)力學(xué)，ETV7表達(dá)增加了LCMVArmstrong的病毒載量。作者還使用P14小鼠模型研究了慢性感染期間CD8+T細(xì)胞的分化動(dòng)力學(xué)。在慢性感染條件下，P14細(xì)胞中耗竭標(biāo)記的表達(dá)逐漸增加至高水平，而記憶標(biāo)記的表達(dá)則保持在低水平。與急性感染類似，ETV7顯著抑制了記憶標(biāo)記的表達(dá)，并顯著增加了耗竭標(biāo)記的表達(dá)。與這一發(fā)現(xiàn)一致的是，觀察到預(yù)耗竭T細(xì)胞數(shù)量減少，而終末耗竭T細(xì)胞（TEX）數(shù)量增加。此外，ETV7表達(dá)減少了病毒特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量、病毒載量以及四聚體+細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)表明，ETV7在急性感染和慢性感染中均具有抑制病毒清除的功能。

作者進(jìn)一步將研究擴(kuò)展到人類。在感染急性嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的個(gè)體中，CD8+T細(xì)胞中較高的ETV7表達(dá)顯示出較低的記憶狀態(tài)比例，但較高的終末耗竭狀態(tài)比例。通過(guò)對(duì)慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染個(gè)體的單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，作者發(fā)現(xiàn)表達(dá)較高水平ETV7的CD8+T細(xì)胞具有較低的增殖和記憶狀態(tài)比例，以及較高的終末耗竭評(píng)分。這些觀察結(jié)果共同支持了ETV7可能是一個(gè)調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)，將CD8+T細(xì)胞引導(dǎo)至耗竭階段的觀點(diǎn)。

圖3 ETV7使CD8+ T細(xì)胞從記憶表型分化到衰竭表型

4. ETV7抑制CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤功能

鑒于ETV7在CD8+T細(xì)胞分化為耗竭狀態(tài)中的關(guān)鍵作用，研究者研究了ETV7是否抑制CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能。研究者首先研究了在高到低TCR刺激水平下ETV7對(duì)T細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。值得注意的是，即使在極低水平的TCR刺激下，ETV7也能促進(jìn)T細(xì)胞耗竭。因此，增殖、細(xì)胞因子表達(dá)以及殺傷腫瘤細(xì)胞的能力均被ETV7表達(dá)所抑制，這表明即使在低水平的TCR刺激下，ETV7也能削弱T細(xì)胞的功能。此外，ETV7表達(dá)增加了CD8+T細(xì)胞的死亡率，而通過(guò)兩種gRNA敲除ETV7可有效促進(jìn)人類CD8+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子表達(dá)，即使在低水平的TCR刺激下也是如此。在人類原代CD8+T細(xì)胞中，ETV7過(guò)表達(dá)抑制了細(xì)胞因子表達(dá)和增殖，同時(shí)增強(qiáng)了細(xì)胞死亡（圖4a-d）。相反，gRNA敲除ETV7則增強(qiáng)了細(xì)胞因子的表達(dá)和增殖能力，降低了細(xì)胞死亡率（圖4a-d）。為了確定ETV7在病毒感染期間對(duì)CD8+T細(xì)胞命運(yùn)決定的影響，研究者將表達(dá)ETV7或載體對(duì)照的P14CD8+T細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)，隨后用LCMVclone13感染（圖4e）。值得注意的是，在LCMVclone13感染后第3天，ETV7抑制了P14CD8+T細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)了細(xì)胞死亡（圖4f,g）。這些數(shù)據(jù)表明，ETV7抑制了CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能。此外，ETV7缺失增加了抗原敏感性，表明ETV7可能是一個(gè)增強(qiáng)T細(xì)胞識(shí)別和殺傷抗原低表達(dá)癌細(xì)胞能力的靶點(diǎn)。研究者隨后在兩種小鼠模型（黑色素瘤B16-OVA細(xì)胞和結(jié)腸腺癌MC38-OVA細(xì)胞）中評(píng)估了抗腫瘤功能。將經(jīng)過(guò)OVA肽預(yù)處理的OT-ICD8+T細(xì)胞（過(guò)表達(dá)ETV7或載體對(duì)照）轉(zhuǎn)移至免疫缺陷且攜帶B16-OVA或MC38-OVA腫瘤的小鼠體內(nèi)（圖5a）。令人驚訝的是，接受ETV7過(guò)表達(dá)OT-I細(xì)胞的小鼠比對(duì)照組小鼠形成了更大的B16-OVA源性腫瘤，并且壽命更短（圖5b-d）。此外，表達(dá)ETV7的腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出記憶表型減少和耗竭表型增加（圖5e,f）。相應(yīng)地，在ETV7過(guò)表達(dá)的情況下，觀察到腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞因子產(chǎn)生和增殖能力降低、T細(xì)胞死亡增加以及腫瘤細(xì)胞死亡減少（圖5g-k）。類似地，ETV7過(guò)表達(dá)促進(jìn)了MC38-OVA源性腫瘤的進(jìn)展，并誘導(dǎo)了腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞的耗竭。此外，耗竭總CD4+T細(xì)胞對(duì)ETV7的腫瘤促進(jìn)功能以及CD8+T細(xì)胞耗竭的影響較小。這些研究表明，ETV7能夠限制CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤功能。

圖4 ETV7控制CD8+ T細(xì)胞的命運(yùn)

圖5 ETV7抑制CD8+ T細(xì)胞的抗腫瘤功能

5. ETV7小鼠增加腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞的耗竭

接下來(lái)，研究者通過(guò)選擇性地將ETV7導(dǎo)入造血干細(xì)胞Lineage?Sca1+cKit+（LSK）細(xì)胞中，探索了ETV7對(duì)體內(nèi)腫瘤進(jìn)展的影響。在移植到致死性輻照受體小鼠兩個(gè)月后，嵌合體在外周血中成熟并被分析（圖6a）。盡管存在ETV7表達(dá)，但在CD8+T細(xì)胞和其他白細(xì)胞類型的比例和數(shù)量上未觀察到異常。如預(yù)期所示，ETV7在LSK細(xì)胞和成熟的CD8+T細(xì)胞中均有效表達(dá)（圖6b）。在此基礎(chǔ)上，研究者用B16腫瘤細(xì)胞接種對(duì)照組和表達(dá)ETV7的小鼠。與對(duì)照組小鼠相比，表達(dá)ETV7的小鼠顯示出B16腫瘤生長(zhǎng)更快、腫瘤重量更高以及生存時(shí)間更短（圖6c,d）。進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞中記憶基因表達(dá)減少，而耗竭基因表達(dá)增加，細(xì)胞因子分泌也減少（圖6e-g）。研究者隨后研究了ETV7表達(dá)的臨床相關(guān)性。由于食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCA）顯示出ETV7與耗竭之間最重要的相關(guān)性，并且在所有癌癥類型中ETV7+T細(xì)胞的頻率最高（圖2），研究者收集了ESCA患者的鮮組織以測(cè)量ETV7蛋白水平。高水平的ETV7與記憶蛋白TCF1表達(dá)減少和耗竭蛋白PD1和TOX表達(dá)增加密切相關(guān)（圖6h）。與研究者的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)一致，在ESCA患者中，ETV7mRNA水平與記憶評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與耗竭評(píng)分呈正相關(guān)，并且隨著ESCA的分期增加，ETV7的表達(dá)也增加（圖6i），這表明ETV7可能通過(guò)促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的終末耗竭在ESCA的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)揭示ETV7主要表達(dá)在T細(xì)胞中，研究者結(jié)合了癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中的批量RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和生存信息，以評(píng)估ETV7表達(dá)的臨床結(jié)果。關(guān)鍵的是，在ESCA和多種其他實(shí)體瘤中，高ETV7表達(dá)組的生存率低于低表達(dá)組（圖6j）。這些發(fā)現(xiàn)表明，ETV7的高表達(dá)可能導(dǎo)致逃避已知的CD8+T細(xì)胞靶點(diǎn)，并且ETV7水平可能是一個(gè)預(yù)測(cè)對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）治療反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物。為了進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，研究者納入了7名接受新輔助PD1抑制劑治療的ESCA患者。研究者將這些患者分為ETV7high（n=4）和ETV7low（n=3）兩組，并分析了他們的病理反應(yīng)。

值得注意的是，所有ETV7low組患者發(fā)生病理降期，而ETV7high組患者的總體臨床分期變化極?。▓D6k）。此外，在黑色素瘤患者中，ETV7表達(dá)水平與ICB治療的反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。這些臨床預(yù)后分析進(jìn)一步支持了CD8+T細(xì)胞中ETV7的高表達(dá)可能限制其在TME中的抗腫瘤功能，并且ETV7可以作為ICB反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物。

圖6 在ESCA小鼠和個(gè)體中，ETV7增加腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞的衰竭

6. ETV7驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄程序向耗竭狀態(tài)發(fā)展

ETV7能夠結(jié)合ETS共識(shí)序列（GGAA）并調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性，但目前尚不清楚其在T細(xì)胞中靶向哪些基因?；谀[瘤樣本的單細(xì)胞ATAC測(cè)序（scATAC-seq）數(shù)據(jù)，ETV7的結(jié)合基序在CD8+T細(xì)胞終末分化過(guò)程中既存在于開(kāi)放區(qū)域，也存在于閉合區(qū)域（圖7a、b）。值得注意的是，研究者發(fā)現(xiàn)一些包含ETV7結(jié)合基序的閉合區(qū)域位于記憶標(biāo)記基因附近，包括TCF7（以及CXCR4、CXCR5和EOMES），而一些包含ETV7結(jié)合基序的開(kāi)放區(qū)域則位于耗竭標(biāo)記基因附近，包括CTLA4和TOX（以及PDCD1、TNFRSF9、HAVCR2、CXCL13和LAG3），這一現(xiàn)象在癌癥患者（圖7c）和丙型肝炎病毒（HCV）感染患者中均有發(fā)現(xiàn)。因此，研究者推測(cè)ETV7可能會(huì)結(jié)合這些記憶和耗竭基因的啟動(dòng)子。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者通過(guò)ChIP-qPCR篩選了TCF7、CTLA4和TOX的閉合和開(kāi)放區(qū)域中包含ETV7結(jié)合基序的基因組位點(diǎn)。結(jié)果表明，在人類和小鼠CD8+T細(xì)胞耗竭過(guò)程中，ETV7與這些位點(diǎn)的結(jié)合顯著增加（圖7d）。此外，啟動(dòng)子活性研究表明，ETV7抑制了TCF7啟動(dòng)子的活性，同時(shí)促進(jìn)了CTLA4和TOX啟動(dòng)子的活性（圖7e）。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，ETV7過(guò)表達(dá)顯著增加了TCF7、CTLA4和TOX的mRNA和蛋白水平（圖7f、g）。此外，ETV7下調(diào)了記憶基因（如CXCR4、EOMES和CXCR5）的表達(dá)，上調(diào)了耗竭基因（如CXCL13、LAG3、PDCD1、TIM3和TNFRSF9）的表達(dá)。相反，在人類CD8+T細(xì)胞中敲除ETV7會(huì)使表達(dá)模式從耗竭狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃洜顟B(tài)（圖3b、c）。在小鼠黑色素瘤和結(jié)腸腺癌中，ETV7的表達(dá)導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞中記憶基因表達(dá)減少，而耗竭基因表達(dá)增加（圖5和6）。為了在臨床環(huán)境中驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，研究者分析了多種實(shí)體瘤scRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ETV7與記憶基因表達(dá)呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，與耗竭基因表達(dá)呈正相關(guān)，其中食管鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)性最高。這些結(jié)果表明，ETV7作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄節(jié)點(diǎn)，通過(guò)結(jié)合記憶和耗竭基因來(lái)調(diào)控T細(xì)胞終末分化的基因表達(dá)。

圖7 ETV7在CD8+T細(xì)胞中作為轉(zhuǎn)錄節(jié)點(diǎn)，控制記憶和耗竭基因的表達(dá)

7. ETV7缺失改善CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤治療效果

CAR-T細(xì)胞耗竭是實(shí)體瘤治療效果的主要障礙。在分析了接受抗CD19CAR-T細(xì)胞治療的B細(xì)胞惡性腫瘤患者的scRNA-seq數(shù)據(jù)集后，研究者發(fā)現(xiàn)CD8+細(xì)胞中ETV7mRNA水平與記憶評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與耗竭評(píng)分呈正相關(guān)（圖8a）。此外，與完全緩解（CR）組相比，部分緩解/疾病進(jìn)展（PR/PD）組的ETV7表達(dá)水平更高，表明ETV7表達(dá)水平與接受抗CD19CAR-T細(xì)胞治療患者的反應(yīng)和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（圖8b）。這些數(shù)據(jù)表明，ETV7可能會(huì)抑制CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效果。盡管CAR-T細(xì)胞治療在白血病中顯示出有希望的結(jié)果，但實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞治療仍面臨諸多障礙和困難。為了提高CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中的抗腫瘤能力，研究者通過(guò)共表達(dá)ETV7shRNA生成了抗間皮素（抗MSLN）的CAR-T細(xì)胞。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)ETV7敲低改造的CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出正常的擴(kuò)增潛力和短期（2.5h）癌細(xì)胞殺傷能力。研究者還測(cè)量了長(zhǎng)期分化（14天）情況，發(fā)現(xiàn)ETV7缺失增加了CAR-T細(xì)胞的記憶群體比例（圖8c）。此外，經(jīng)過(guò)ETV7敲低后，CAR-T細(xì)胞的耗竭群體比例和耗竭相關(guān)基因表達(dá)均有所降低（圖8d-f）。因此，ETV7敲低使CAR-T細(xì)胞從耗竭狀態(tài)轉(zhuǎn)向記憶狀態(tài)。研究者進(jìn)一步在臨床前實(shí)體瘤模型中研究了ETV7失活的CAR-T細(xì)胞的表現(xiàn)。在免疫缺陷小鼠中植入過(guò)表達(dá)MSLN的OVCAR8細(xì)胞后，通過(guò)尾靜脈注射轉(zhuǎn)移了帶有或不帶有ETV7敲低的CAR-T細(xì)胞。與對(duì)照組CAR-T細(xì)胞相比，ETV7缺失的CAR-T細(xì)胞顯著減緩了腫瘤進(jìn)展（圖8g），并延長(zhǎng)了生存期。一致地，ETV7缺失增加了腫瘤浸潤(rùn)性CAR-T細(xì)胞的比例，并與PD1+T細(xì)胞群體的增加密切相關(guān)（圖8h-k）。綜上所述，這些結(jié)果表明，ETV7缺失可以改善CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的治療效果，這可能為免疫治療提供了有希望的轉(zhuǎn)化潛力。

圖8 ETV7耗竭阻斷CAR-T細(xì)胞耗竭，改善CAR-T細(xì)胞抗腫瘤治療

結(jié)論：

ETV7是決定CD8+T細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄程序向耗竭狀態(tài)轉(zhuǎn)變，限制了CD8+T細(xì)胞的抗病毒和抗腫瘤效能。ETV7在多種人類癌癥中表達(dá)水平與疾病進(jìn)展呈正相關(guān)，且與免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的響應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)，其缺失可顯著增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和工程化CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中的抗腫瘤效能，因此ETV7有望成為改善癌癥免疫治療效果的潛在靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。

實(shí)驗(yàn)方法：

單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）、單細(xì)胞ATAC測(cè)序（scATAC-seq）、流式細(xì)胞術(shù)、CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)、慢病毒介導(dǎo)的基因過(guò)表達(dá)、ChIP-qPCR、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)、CAR-T細(xì)胞制備與功能測(cè)試。

參考文獻(xiàn)

Cheng, J., Xiao, Y., Peng, T. et al. ETV7 limits the antiviral and antitumor efficacy of CD8+ T cells by diverting their fate toward exhaustion. Nat Cancer (2025). https://doi.org/10.1038/s43018-024-00892-0