硒代半胱氨酸（Sec）代謝對(duì)細(xì)胞功能和鐵死亡預(yù)防至關(guān)重要，首先涉及硒代半胱氨酸載體——硒蛋白P（SELENOP）的攝取。攝取后，從SELENOP釋放的Sec通過(guò)硒代半胱氨酸裂解酶（SCLY）代謝，生成硒化氫，這是一種用于硒酰基合成酶2（SEPHS2）的底物，后者提供必需的硒供體——硒酰基（H2SePO3-），用于硒代半胱氨酸t(yī)RNA的生物合成。在此，本研究發(fā)現(xiàn)了一條由過(guò)氧化物酶體6（PRDX6）介導(dǎo)的獨(dú)立于SCLY的Sec代謝替代途徑。從機(jī)制上講，本研究證明了PRDX6能夠與硒化氫迅速反應(yīng)并與SEPHS2相互作用，可能充當(dāng)硒的傳遞系統(tǒng)。此外，本研究還展示了這一替代途徑在人體癌細(xì)胞中的功能重要性，揭示了PRDX6高表達(dá)與人類MYCN擴(kuò)增的神經(jīng)母細(xì)胞瘤亞型之間的顯著關(guān)聯(lián)。本研究揭示了Sec代謝中一個(gè)先前未被認(rèn)識(shí)的方面及其在鐵死亡中的影響，為治療開(kāi)發(fā)提供了進(jìn)一步的可能性。本文于2024年12月發(fā)表在《Molecular Cell》，IF14.5。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 硒代半胱氨酸依賴性鐵死亡調(diào)控因子的鑒定

利用來(lái)自硒蛋白P（SELENOP）的硒代半胱氨酸（Sec）或其他硒蛋白的降解，需要通過(guò)硒代半胱氨酸裂解酶（SCLY）釋放Sec中的硒原子（圖1A）。鑒于我們最近發(fā)現(xiàn)SELENOP/LRP8軸在MYCN擴(kuò)增的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中預(yù)防鐵死亡的重要性，我們?cè)噲D探究SCLY的缺失是否能阻止神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中硒蛋白的產(chǎn)生，并為誘導(dǎo)該實(shí)體中的鐵死亡提供額外的靶點(diǎn)。我們使用了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-DZ，并利用三種獨(dú)立的單向?qū)NA（sgRNAs）構(gòu)建了SCLY缺陷細(xì)胞（SCLYKO），以LRP8 sgRNA作為對(duì)照。LRP8缺陷細(xì)胞（LRP8KO）顯著降低了硒蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)為硒蛋白N（SELENON）和GPX4的喪失，并誘導(dǎo)了鐵死亡，如前所述。相比之下，SCLYKO并未影響這些硒蛋白的水平，但仍然觸發(fā)了鐵死亡。然而，與LRP8KO細(xì)胞相比，SCLYKO細(xì)胞死亡可以通過(guò)較低濃度的鐵死亡抑制劑liproxstatin-1（Lip1）預(yù)防。這些數(shù)據(jù)表明，SCLY的缺失并沒(méi)有完全模仿LRP8的缺失（圖1B）。

圖1 PRDX6作為鐵死亡調(diào)節(jié)因子的鑒定

有趣的是，向SCLYKO細(xì)胞補(bǔ)充氧化形式的L-硒代半胱氨酸（L-Sec-Sec），顯著提高了硒蛋白GPX4和SELENON的水平（圖1C），并拯救了它們的生存，這表明存在一條不依賴于SCLY的促進(jìn)Sec利用的途徑。因此，我們利用這一特性來(lái)識(shí)別促進(jìn)SCLYKO細(xì)胞系中Sec使用的因子。為此，我們?cè)诳寺〉腟CLYKO SK-N-DZ細(xì)胞系中進(jìn)行了全基因組CRISPR功能喪失篩選，以識(shí)別可以在沒(méi)有SCLY的情況下促進(jìn)Sec依賴的硒蛋白產(chǎn)生的替代途徑。篩選設(shè)計(jì)了兩種條件：L-Sec-Sec補(bǔ)充（50 nM）作為唯一的補(bǔ)充物，防止鐵死亡，以及完全保護(hù)鐵死亡的條件（500 nM Lip1結(jié)合低濃度的Na2SeO3，20 nM）（圖1D）。使用Lip1和較低劑量的替代硒源是必要的，以避免由于嚴(yán)重硒饑餓導(dǎo)致的增殖差異。Lip1被包括在內(nèi)，以緩沖可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡的GPX4水平波動(dòng)，而這些波動(dòng)不能由低劑量的亞硒酸鈉維持。與對(duì)照條件相比，篩選在L-Sec-Sec條件下識(shí)別出針對(duì)PRDX6的sgRNA顯著減少（圖1E），表明該蛋白可能參與Sec的利用。

2 PRDX6的磷脂過(guò)氧化物酶活性不影響鐵死亡抵抗

考慮到大量研究表明PRDX6與GPX4類似，可以作為磷脂過(guò)氧化物酶，因此PRDX6因缺乏這種次要的磷脂過(guò)氧化氫酶機(jī)制而得分似乎是合理的，這種情況在篩選的Lip1處理組中不太可能發(fā)生（圖2A）。為了探究PRDX6的GPX4樣活性是否對(duì)觀察到的表型有貢獻(xiàn)，我們首先重新研究了大鼠PRDX6（rPrdx6）對(duì)不同過(guò)氧化氫的反應(yīng)，使用停止流動(dòng)光譜法，確定了對(duì)H2O2、亞油酸（單）過(guò)氧化氫（LAOOH）和磷脂酰膽堿（單）過(guò)氧化氫（PCOOH）的速率常數(shù)分別為3.0±0.2 ×10^7、1.4±0.04 ×10^5和3.4±0.1 ×10^4 M^-1s^-1。與H202的速率常數(shù)與先前的報(bào)告一致?？紤]到過(guò)氧化磷脂是推動(dòng)鐵死亡的主要底物，值得注意的是，PRDX6對(duì)這些底物的效率比GPX4低3到4個(gè)數(shù)量級(jí)，GPX4對(duì)PCOOH的報(bào)告速率常數(shù)接近10^8 M^-1s^-1。這些結(jié)果表明，如果兩種蛋白在體內(nèi)表達(dá)水平相似，PRDX6的磷脂過(guò)氧化氫酶活性被GPX4所取代。為了進(jìn)一步探索這一點(diǎn)，我們?cè)赑fa1細(xì)胞（來(lái)自4-羥基他莫昔芬[Tam]誘導(dǎo)的Gpx4?/?模型的成纖維細(xì)胞）中過(guò)表達(dá)了PRDX6、SCLY、LRP8和FSP1。這個(gè)模型允許在用Tam處理后遺傳性地刪除Gpx4，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。值得注意的是，Pfa1細(xì)胞的內(nèi)源性Lrp8表達(dá)較低，這為研究這些因素之間的相互作用提供了一個(gè)受控的環(huán)境。在過(guò)表達(dá)的cDNA中，只有FSP1能夠補(bǔ)充Gpx4的缺失（圖2C、2D）。顯著的是，PRDX6不能補(bǔ)充Gpx4的遺傳性缺失，這表明其GPX4樣功能并不顯著。此外，只有LRP8和FSP1的過(guò)表達(dá)能夠增加對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑的抵抗力，使細(xì)胞對(duì)一系列鐵死亡誘導(dǎo)劑產(chǎn)生抵抗力。為了支持這些觀察，我們采用了一個(gè)缺乏GPX4并完全依賴FSP1生存的工程細(xì)胞系（HT1080GPX4KO FSP1-OE）（圖2F）。我們使用這些模型通過(guò)高度特異性的抑制劑iFSP1阻斷FSP1來(lái)引發(fā)鐵死亡。與PRDX6、SCLY和LRP8缺陷細(xì)胞對(duì)典型鐵死亡誘導(dǎo)劑的增加敏感性不同，這些誘導(dǎo)劑直接或間接作用于GPX4，任何硒蛋白調(diào)節(jié)因子的遺傳性缺失在GPX4獨(dú)立的情況下并不影響鐵死亡的敏感性（圖2G）。

圖2 PRDX6磷脂氫過(guò)氧化物酶活性與抗鐵死亡無(wú)關(guān)

3 PRDX6調(diào)節(jié)硒代半胱氨酸代謝和鐵死亡敏感性

在正式排除了PRDX6在鐵死亡中類似GPX4的活性后，我們接下來(lái)探索了PRDX6在硒代半胱氨酸（Sec）代謝中的潛在作用。為此，我們使用三種單向?qū)NA（sgRNAs）在SK-N-DZ細(xì)胞系中敲除了PRDX6（PRDX6KO）。PRDX6的缺失導(dǎo)致了鐵死亡，盡管與LRP8KO細(xì)胞相比，PRDX6KO細(xì)胞可以用較低濃度的Lip1挽救（圖3A，右）。此外，PRDX6KO細(xì)胞的SELENON和GPX4表達(dá)水平降低，類似于LRP8的缺失（圖3A，左）。用L-Sec-Sec（50 nM）處理誘導(dǎo)了PRDX6KO細(xì)胞系中GPX4和SELENON水平的增加，雖然這一增加程度小于野生型（WT）細(xì)胞系（圖3B），這表明PRDX6在從Sec中輸送硒方面發(fā)揮作用。這一假設(shè)通過(guò)使用DepMap（www.depmap.org）分析LRP8的共依賴性進(jìn)一步得到加強(qiáng)（圖3C）。這種計(jì)算方法基于這樣一個(gè)觀察：影響同一或相關(guān)途徑中組分的遺傳擾動(dòng)通常表現(xiàn)出相似的依賴性。正如預(yù)期，LRP8共依賴性分析揭示了幾種涉及硒蛋白生物合成的酶（真核延伸因子，硒代半胱氨酸t(yī)RNA特異性[EEFSEC]，SCLY，SEPHS2，以及O-磷酸硒tRNA(Sec)硒轉(zhuǎn)移酶[SEPSECS]）。值得注意的是，PRDX6與LRP8的共依賴性得分最高，從而加強(qiáng)了這兩種蛋白與Sec代謝之間的功能關(guān)系（圖3C），這與之前的計(jì)算工作一致。

圖3 PRDX6影響硒代半胱氨酸代謝及對(duì)鐵死亡的敏感性

鑒于PRDX6和SCLY的缺失均未能完全復(fù)現(xiàn)LRP8的缺失，并且兩者仍能利用硒代半胱氨酸（Sec）合成新的硒蛋白，我們探索了SCLY和PRDX6之間可能存在的冗余性。因此，我們構(gòu)建了SCLY和PRDX6雙敲除細(xì)胞（SCLYKO/PRDX6KO）。與LRP8KO相似，而與單獨(dú)敲除SCLY或PRDX6不同，這兩個(gè)基因的同時(shí)敲除顯著降低了GPX4和SELENON的表達(dá)（圖3D，左），并且需要更高濃度的Lip1來(lái)挽救（圖3D，右）。接下來(lái)，我們?cè)u(píng)估了這些細(xì)胞在撤去Lip1后自發(fā)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的傾向。在撤去Lip1 24小時(shí)后，使用BODIPY-C11評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化，結(jié)果顯示SCLYKO/PRDX6KO細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化增加更為顯著，與LRP8KO及SCLY或PRDX6的單獨(dú)缺失相比（圖3E）。為了進(jìn)一步擴(kuò)展這一觀察，我們?cè)谝幌盗屑?xì)胞系中單獨(dú)和組合敲除SCLY和PRDX6，確認(rèn)SCLYKO和PRDX6KO破壞了GPX4的表達(dá)，在SCLYKO/PRDX6KO細(xì)胞中效果更為明顯。值得注意的是，在非神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，無(wú)論是單獨(dú)缺失（SCLYKO或PRDX6KO）還是雙缺失（SCLYKO/PRDX6KO）均未導(dǎo)致自發(fā)鐵死亡。盡管如此，它們對(duì)一系列誘導(dǎo)鐵死亡的化合物顯示出增加的敏感性，并且BODIPY-C11氧化也有所增加。這些觀察結(jié)果復(fù)現(xiàn)了我們最近對(duì)LRP8缺失的表型報(bào)道。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PRDX6在調(diào)節(jié)硒蛋白水平中的功能，我們?cè)赟CLYKO/PRDX6KO SK-N-DZ（單克隆C21）細(xì)胞中重新引入了PRDX6和SCLY，觀察到在PRDX6或SCLY重建后GPX4和SELENON表達(dá)的恢復(fù)（圖3F）。此外，PRDX6或SCLY的強(qiáng)制表達(dá)部分挽救了雙KO細(xì)胞免于鐵死亡，表明這些蛋白在平行且獨(dú)立的途徑中發(fā)揮作用（圖3G）。接下來(lái)，我們專注于識(shí)別PRDX6促進(jìn)Sec代謝的特征。我們生成并研究了一系列PRDX6突變體，以評(píng)估它們對(duì)調(diào)節(jié)硒蛋白水平的影響。這些突變體包括推測(cè)的過(guò)氧化物酶缺陷型（C47S）、磷脂酶缺陷型（S32A）、二聚化缺陷型（C91S）和硫辛酸不穩(wěn)定型（H39A或H39Y）突變體。我們的結(jié)果表明，在SCLYKO/PRDX6KO中，野生型PRDX6、S32A和C91S的恢復(fù)，而不是C47S、H39A或H39Y變體，部分恢復(fù)了GPX4的表達(dá)和細(xì)胞活力。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了過(guò)氧化物酶活性半胱氨酸和PRDX6活性位點(diǎn)的正確配置在促進(jìn)硒蛋白表達(dá)和保護(hù)免受鐵死亡中的關(guān)鍵重要性。

鑒于我們報(bào)道了PRDX6和LRP8之間高度的共依賴性（圖3C），我們推斷PRDX6可能在LRP8下游發(fā)揮作用。為了調(diào)查這一點(diǎn)，我們?cè)谶^(guò)表達(dá)LRP8的SK-N-DZ細(xì)胞中生成了PRDX6KO、SCLYKO和SCLYKO/PRDX6KO。利用這些細(xì)胞系，我們揭示了SELENOP刺激的硒蛋白生產(chǎn)在PRDX6KO中受到破壞，在SCLYKO/PRDX6KO中完全消失。放射性標(biāo)記的SELENOP（75Se-SELENOP）補(bǔ)充證實(shí)了硒蛋白中75Se的整合受損。重復(fù)先前的觀察結(jié)果，純化的硒豐富的SELENOP（+Se）而不是硒貧乏的SELENOP（-Se）只有在表達(dá)PRDX6或SCLY的細(xì)胞中才導(dǎo)致硒蛋白增加（圖3H）。此外，在SCLYKO/PRDX6KO背景下，只有PRDX6野生型、S32A和C91S的重建，而不是C47S或H39A突變體，能夠恢復(fù)SELENOP刺激的硒蛋白翻譯（圖3I）。為了測(cè)試PRDX6是否對(duì)硒源的類型有選擇性，我們用L-Sec-Sec、L-硒蛋氨酸（L-SeMet）和亞硒酸鈉（Na2SeO3）處理細(xì)胞。有趣的是，Na2SeO3和L-SeMet同樣可以促進(jìn)GPX4和SELENON的表達(dá)。然而，在SCLYKO/PRDX6KO細(xì)胞中，L-Sec-Sec處理后的硒蛋白合成受到強(qiáng)烈抑制（圖3J），表明PRDX6的效果與Sec的代謝直接相關(guān)，并在SELENOP蛋白水解下游發(fā)揮作用。有趣的是，盡管L-Sec-Sec在野生型、SCLYKO和PRDX6KO中同樣有效地促進(jìn)了硒蛋白的表達(dá)，但其對(duì)映異構(gòu)體D-Sec-Sec在所有基因型中均未能有效促進(jìn)硒蛋白的表達(dá)（圖3K），這表明PRDX6分支中Sec的分解主要通過(guò)酶促方式進(jìn)行。我們?cè)诹硗鈨蓚€(gè)細(xì)胞系中復(fù)現(xiàn)了這些觀察結(jié)果?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明PRDX6優(yōu)先需要用于以Sec形式存在的有機(jī)硒的代謝，并且這并不僅限于來(lái)自SELENOP的Sec。

4 PRDX6與氫硒化物反應(yīng)

在證實(shí)PRDX6促進(jìn)硒蛋白生物合成后，我們?nèi)匀鄙僖粋€(gè)機(jī)制上的聯(lián)系。初步嘗試并未顯示PRDX6具有脫硒酶活性，這使得它不太可能像SCLY那樣發(fā)揮作用。PRDX6以穩(wěn)定的磺酸形式存在，這一特性可能促進(jìn)其與HSe?的相互作用，類似于磺酸與H2S之間的反應(yīng)，導(dǎo)致硫醚（R-SSH）的形成。在HSe?的背景下，這一反應(yīng)可能導(dǎo)致硫硒化物（R-S-Se）中間體的形成，該中間體可能介導(dǎo)硒向SEPHS2的轉(zhuǎn)移。

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們生產(chǎn)了重組PRDX6，其中非催化半胱氨酸C91被突變?yōu)槠渌锓N中發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)氨基酸（C91G），這樣做是為了避免由非特異性氧化，包括二聚化引起的混淆結(jié)果。我們還證實(shí)了C91對(duì)于鐵死亡和硒蛋白生產(chǎn)是可有可無(wú)的，因?yàn)橹挥蠧47是恢復(fù)對(duì)鐵死亡的抵抗力和硒蛋白表達(dá)所必需的。我們?cè)谕ㄟ^(guò)完整蛋白質(zhì)譜分析人類PRDX6(C91G)時(shí)，最初做出了兩個(gè)意外的觀察。首先，我們無(wú)法始終如一地準(zhǔn)備一個(gè)完全還原的蛋白，這表明磺酸（SOH）形式要么不能完全接觸還原劑，要么在去除還原劑后迅速重新形成。其次，SOH峰（+16）與另一個(gè)峰（+60）的存在相關(guān)，這似乎是SOH形式（+16+44）的衍生物（圖4A）。我們無(wú)法明確證明這種衍生物的化學(xué)身份，但我們懷疑它是在磺酸上形成的乙酸加合物，很可能是我們高效液相色譜（HPLC）-質(zhì)譜（MS）過(guò)程中的人工產(chǎn)物。對(duì)于C47/91S雙突變體，觀察不到代表氧化的兩個(gè)峰（+16/+60），從而證實(shí)了磺酰化發(fā)生在過(guò)氧化物酶活性（C47）半胱氨酸上。使用人類PRDX6(C91G)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)支持了PRDX6捕獲HSe?的提議機(jī)制，我們能夠證明：（1）向蛋白質(zhì)提供額外的H2O2（以1:1的化學(xué)計(jì)量比）幾乎完全將還原形式轉(zhuǎn)化為SOH形式（+16）及其衍生物（+60）（圖4B）。（2）隨后添加SOH捕獲試劑二甲基酮導(dǎo)致預(yù)期的二甲基酮加合物（+138），再次證實(shí)了磺酸的存在和可接近性（圖4E）。（3）PRDX6與H2O2和Na2Se（1:1:1）的共培養(yǎng)導(dǎo)致了PRDX6硫硒化物（PRDX6-S-Se?）的直接檢測(cè)（圖4C和4D），強(qiáng)烈支持磺酸直接與HSe?反應(yīng)的觀點(diǎn)。此外，用二甲基酮阻斷磺酸抑制了R-S-Se?的檢測(cè)（圖4F）。C47S突變體消除了反應(yīng)。所有這些觀察結(jié)果匯總并表明，PRDX6-SOH，而不是還原形式，能夠捕獲環(huán)境HSe?，將其轉(zhuǎn)化為蛋白結(jié)合的硒化物（圖4G）。

圖4 PRDX6與硒化氫反應(yīng)，形成假定的SEPHS2硒供體

在使用rPrdx6的研究中，我們?cè)诖嬖贜a2Se的條件下，在pH 7.4時(shí)檢測(cè)到了一個(gè)氧化的R-S-Se?產(chǎn)物（rPrdx6-S-SeO2H）（圖4H）。這一峰值在C47S突變體中并未形成（圖4I）。氧化的R-S-Se?的形成可能是由于在此反應(yīng)中使用的HSe?濃度較高，導(dǎo)致過(guò)氧化氫的產(chǎn)生和隨后的R-S-Se?氧化。我們還用其他硒化合物測(cè)試了PRDX6與硒的結(jié)合。有趣的是，在中性pH（7.4）下，rPrdx6與L-Sec的反應(yīng)性較差，而在酸性pH下，所有硒化合物（SeCys，HSe?，SeO32?）都能與蛋白質(zhì)反應(yīng)。這些觀察結(jié)果表明，在酸性pH條件下PRDX6能夠與各種硒化合物發(fā)生作用，而在中性（細(xì)胞質(zhì)）條件下對(duì)小分子如HSe?表現(xiàn)出選擇性。亞硒酸鈉也能與PRDX6反應(yīng)；然而，只有在存在GSH的情況下，才能在中性pH下檢測(cè)到R-S-Se?的形成，這可能是因?yàn)檫@一反應(yīng)能夠產(chǎn)生氫硒化物。與其他硒化合物如Sec的反應(yīng)很可能是通過(guò)一種不涉及酶氧化形式的不同機(jī)制進(jìn)行的。

接下來(lái)，我們使用分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬來(lái)分析rPrdx6活性位點(diǎn)在模擬過(guò)程中溶劑可接觸表面積（SASA）的變化。值得注意的是，與在pH 7下進(jìn)行的模擬相比，pH 5下進(jìn)行的模擬中活性位點(diǎn)的SASA值總體上更高（平均值= 521.5 ±52.2 ?2；中位數(shù)= 520.2 ?2）。此外，與pH 7相比，pH 5下活性位點(diǎn)的平均SASA值隨時(shí)間保持較高。我們進(jìn)一步分析了催化殘基C47的SASA值的變化。與整個(gè)活性位點(diǎn)觀察到的情況類似，pH 5下C47的SASA值高于pH 7（平均值= 24.6 ± 8.8 ?2；中位數(shù) = 25.2 ?2），并且pH 5下C47的平均SASA值隨時(shí)間保持較高，與pH 7相比。這些數(shù)據(jù)表明，rPrdx6的活性位點(diǎn)，包括催化殘基C47和相應(yīng)的磺酸，在pH 7下溶劑暴露較少。這表明，只有小而可擴(kuò)散的硒化合物，如HSe?，才能接觸到活性位點(diǎn)，可能也保持了R-S-Se?中間體的穩(wěn)定性。確定R-S-Se?中間體至關(guān)重要，因?yàn)樗徽J(rèn)為是向SEPHS2捐贈(zèng)硒的中間體。因此，我們研究了PRDX6和SEPHS2之間可能的相互作用，這在促進(jìn)兩個(gè)酶之間硒原子轉(zhuǎn)移中可能是關(guān)鍵的。為此，我們將超折疊Cherry的分裂部分融合到這些蛋白質(zhì)（和SCLY）。我們將SEPHS2(U60C)的N端或C端與SF-Ch-1-10標(biāo)記，而SF-Ch11標(biāo)記了PRDX6或SCLY的任一端。這些構(gòu)建物被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)到HT1080細(xì)胞中的不同組合。我們?cè)贑端標(biāo)記的PRDX6（PRDX6-SF-Ch 11）、C端標(biāo)記的SEPHS2 U60C（SEPHS2-SF-Ch 1–10）以及N端標(biāo)記的SCLY（SF-Ch 11-SCLY）和SEPHS2-SF-Ch 1–10的組合中檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明SEPHS2與PRDX6和SCLY的相互作用（圖4J、4K）。我們通過(guò)在PRDX6KO SK-N-DZ細(xì)胞中表達(dá)標(biāo)記的PRDX6來(lái)驗(yàn)證其功能，證明它能夠恢復(fù)GPX4和SELENON的表達(dá)和細(xì)胞活力。我們還使用Duolink Proximity Ligation Assay（PLA）在PRDX6 WT（PRDX6WT）和PRDX6KO SK-N-DZ中作為另一種方法來(lái)證明PRDX6和SEPHS2在細(xì)胞中緊密相互作用。鑒于由于Sec的存在，建立一個(gè)穩(wěn)健的SEPHS2酶活性測(cè)定的困難，我們進(jìn)一步探索了PRDX6和SEPHS2之間的潛在相互作用。PRDX6和SEPHS2的配對(duì)被用作ClusPro的輸入，產(chǎn)生了多達(dá)30個(gè)姿勢(shì)。測(cè)量了PRDX6和SEPHS2每個(gè)姿勢(shì)的活性位點(diǎn)之間的距離。然后通過(guò)PyMOL可視化了活性位點(diǎn)之間的最短距離，并比較了不同的姿勢(shì)。在所有PRDX6和SEPHS2組合中，每個(gè)組合的最短距離都低于15 ?，最短距離為9.8 ?（圖4L），為它們的活性位點(diǎn)之間的緊密相互作用提供了模型。

一個(gè)仍需解決的方面是如何使Sec去硒化以產(chǎn)生HSe?。鑒于Sec和半胱氨酸之間的化學(xué)相似性，我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，探索H2S生物合成途徑是否能夠促進(jìn)Sec產(chǎn)生HSe?，并在PRDX6上游發(fā)揮作用。使用SCLYKO缺陷細(xì)胞系，我們生成了缺乏CTH、CBS和MPST的細(xì)胞系。我們假設(shè)如果它們產(chǎn)生HSe?，它們應(yīng)該模擬由硒代半胱氨酸刺激的硒蛋白生產(chǎn)缺陷，如SCLY/PRDX6雙重缺失所觀察到的。然而，任何H2S生成酶的單一缺失并未影響L-Sec-Sec的代謝。這些結(jié)果表明，不同的H2S產(chǎn)生途徑之間存在冗余，或者非酶促機(jī)制可能有助于Sec去硒化。

5 PRDX6對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的貢獻(xiàn)

我們的數(shù)據(jù)顯示，PRDX6和SCLY通過(guò)調(diào)節(jié)硒代半胱氨酸（Sec）代謝來(lái)調(diào)控硒蛋白的產(chǎn)生和鐵死亡。鑒于這一途徑對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的重要性，我們進(jìn)一步評(píng)估了其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型中的作用。隨后，我們將SK-N-DZ LRP8OE細(xì)胞系，包括PRDX6/SCLY野生型（PRDX6WT/SCLYWT）、SCLY敲除（SCLYKO）、PRDX6敲除（PRDX6KO）或PRDX6/SCLY雙敲除（PRDX6KO/SCLYKO）異位植入NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠的腎上腺（圖5A）。與PRDX6WT/SCLYWT相比，SCLYKO和PRDX6KO顯示出腫瘤生長(zhǎng)的減少，而PRDX6KO/SCLYKO對(duì)這些異種移植瘤中LRP8促進(jìn)的增長(zhǎng)影響更為顯著（圖5B）。與體外發(fā)現(xiàn)一致，PRDX6KO腫瘤中GPX4水平降低，而SCLYKO對(duì)GPX4的影響有限，但在PRDX6KO/SCLYKO腫瘤中GPX4蛋白的表達(dá)顯著喪失（圖5C）?？紤]到PRDX6KO/SCLYKO對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和GPX4表達(dá)的強(qiáng)烈影響，我們進(jìn)一步探索了PRDX6和SCLY在腫瘤建立和生長(zhǎng)中的潛在作用。為此，我們通過(guò)將PRDX6WT/SCLYWT和PRDX6KO/SCLYKO的SK-N-DZ細(xì)胞植入NSG小鼠的腎上腺進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了防止鐵死亡，兩組細(xì)胞系在植入前均在Lip1存在下培養(yǎng)。隨后，與PRDX6WT/SCLYWT細(xì)胞相比，PRDX6KO/SCLYKO細(xì)胞顯示出顯著的腫瘤生長(zhǎng)減少，直接影響小鼠的總體生存，KO組的中位生存期為36天，而WT組為26天。

圖5硒代半胱氨酸代謝有助于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)和治療反應(yīng)

接下來(lái)，我們探索了PRDX6/SEPHS2軸是否能夠預(yù)測(cè)兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者隊(duì)列和臨床前模型的臨床結(jié)果。高PRDX6表達(dá)與較差的生存結(jié)果強(qiáng)烈相關(guān)（圖5D）。有趣的是，我們可以在Manas等人描述的臨床相關(guān)的患者衍生異種移植瘤（PDX）模型中推斷出這些觀察結(jié)果，其中使用了類似于順鉑（C）、長(zhǎng)春新堿（O）、卡鉑（J）、依托泊苷（E）和環(huán)磷酰胺（C）（COJEC）的化療方案來(lái)治療反映神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者腫瘤特征的神經(jīng)母細(xì)胞瘤PDX模型。對(duì)這個(gè)數(shù)據(jù)集中兩個(gè)PDX模型的數(shù)據(jù)重新分析使我們能夠識(shí)別出在對(duì)COJEC耐藥的腫瘤中PRDX6表達(dá)增加。此外，在對(duì)COJEC有反應(yīng)的PDX中，隨后進(jìn)行手術(shù)干預(yù)的臨床結(jié)果表明，高PRDX6表達(dá)與復(fù)發(fā)腫瘤相關(guān)。相比之下，較低的表達(dá)與治療性反應(yīng)相關(guān)（圖5E、5F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，PRDX6可以影響患者衍生模型中的硒利用，并且這一硒轉(zhuǎn)移分支的表達(dá)和可能的活性可能調(diào)節(jié)疾病進(jìn)展和對(duì)臨床相關(guān)方案的耐藥性。

結(jié)論

我們的研究以為理解硒和硒代半胱氨酸（Sec）代謝及其對(duì)硒蛋白生物合成的貢獻(xiàn)提供了根本性的貢獻(xiàn)，明確地確立了PRDX6的一個(gè)迄今為止未被報(bào)道的功能，即在不依賴SCLY的情況下促進(jìn)HSe?的有效利用。此外，我們展示了PRDX6/SEPHS2軸與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后不良和復(fù)發(fā)相關(guān)，并且可能被利用來(lái)誘導(dǎo)或使這種腫瘤對(duì)鐵死亡產(chǎn)生敏感性。

實(shí)驗(yàn)方法：

差異表達(dá)基因分析、細(xì)胞聚類分析、KEGG通路分析、免疫細(xì)胞豐度分析、共依賴性分析、結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析、qPCR分析、免疫印跡、重組蛋白反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、酶活性測(cè)定、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染鐵死亡誘導(dǎo)與檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)、硒代謝實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞活力檢測(cè)、腫瘤移植小鼠模型、Kaplan-Meier生存分析、免疫組化、腫瘤生長(zhǎng)曲線、生存率分析

參考文獻(xiàn)：

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