曲妥珠（trastuzumab）單抗、帕妥珠（pertuzumab）單抗和紫杉醇（THP）聯(lián)合新輔助治療可顯著改善人表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2)+乳腺癌（BC）患者的預(yù)后。然而，仍有一部分無(wú)反應(yīng)的患者。因此，本研究試圖確定THP新輔助治療耐藥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和潛在的致敏靶點(diǎn)。利用Cancer Genome Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)、Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)和膜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定THP新佐劑耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因子。采用生物信息學(xué)分析、多重免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、成球?qū)嶒?yàn)和染色質(zhì)免疫沉淀等方法，研究了δ -樣4蛋白（DLL4）在體外和體內(nèi)THP耐藥中的生物學(xué)功能和機(jī)制。此外，建立了靶向DLL4的嵌合抗原受體(CAR)-T細(xì)胞對(duì)THP治療增敏。DLL4被確定為HER2+ BC THP新輔助治療耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究揭示了DLL4在細(xì)胞干性和免疫浸潤(rùn)中的新功能，包括NETs的形成和T細(xì)胞的排斥，這些共同促成了HER2+BC中THP新輔助治療的耐藥。此外，作者提供了一種基于CAR的治療方法來(lái)提高THP新輔助治療的敏感性。該文章于2024年11月發(fā)表在《Journal for immunotherapy of cancer》，IF：10.3。

為了描述影響新輔助化療耐藥的因素并預(yù)測(cè)化療反應(yīng)性，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)三步綜合篩查策略。首先，從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)HER2+ BC中包含擴(kuò)增和缺失的基因拷貝數(shù)變異，并建立了包含111個(gè)擴(kuò)增基因的候選基因庫(kù)（庫(kù)1），作為腫瘤起始的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。接下來(lái)，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE181574和GSE76360）中獲得44例接受新輔助THP治療的HER2+ BC患者和另外30例接受曲妥珠單抗聯(lián)合化療作為新輔助化療的患者的RNA表達(dá)譜。基因富集分析（GSEA）顯示，在非病理完全反應(yīng)（NPCR）組中，免疫相關(guān)通路富集，特別是免疫活性的負(fù)調(diào)控，同時(shí)Notch信號(hào)通路富集。京都基因與基因組百科全書（KEGG）和基因本體（GO）分析也得到了類似的結(jié)果。通過(guò)分析PCR組和NPCR組之間不同的表達(dá)基因（DEGs），確定了NPCR組中含有上調(diào)基因的第二個(gè)候選文庫(kù)（文庫(kù)2）。此外，考慮到膜蛋白可以作為治療性抗體開(kāi)發(fā)和其他藥物的有價(jià)值靶點(diǎn)，作者隨后從許多與膜蛋白相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)（TMbase、Steve White、OPM數(shù)據(jù)庫(kù)和MemProtMD數(shù)據(jù)庫(kù)等）中收集了編碼膜蛋白的候選基因作為作者的第三個(gè)候選庫(kù)。

最后，對(duì)三個(gè)候選基因庫(kù)進(jìn)行交叉，獲得共同的DEG，包括DLL4、SLC22A12、CD24。在這些DEG中，DLL4被鑒定為耐藥患者中差異過(guò)表達(dá)最多的膜蛋白，DLL4過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致THP耐藥。總之，通過(guò)擴(kuò)增基因、NPCR基因和膜蛋白三個(gè)候選文庫(kù)，作者最終確定DLL4是介導(dǎo)THP新輔助化療耐藥的潛在靶點(diǎn)。

首先，作者評(píng)估了DLL4在HER2+BC中的表達(dá)模式。如圖1A、B所示，與匹配的非腫瘤組織相比，THP耐藥腫瘤組織中DLL4的表達(dá)水平異常過(guò)表達(dá)。在作者的中心隊(duì)列和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，低DLL4水平的HER2+患者的總生存期（OS）和疾病特異性生存期（DSS）顯著延長(zhǎng)。此外，在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中THP新輔助化療不良反應(yīng)人群中，DLL4過(guò)表達(dá)（圖1C）。根據(jù)DLL4對(duì)腫瘤細(xì)胞的染色程度和染色強(qiáng)度，將DLL4在HER2+ BC中的表達(dá)分為5個(gè)水平。同樣，HER2+ BC隊(duì)列的回顧性分析顯示，高基線DLL4表達(dá)與MRI確定的THP新輔助化療耐藥和腫瘤大小變化（圖1D-E）顯著相關(guān)。此外，只有腫瘤DLL4表達(dá)水平在PCR和NPCR患者之間存在差異（圖1F），與反應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)（圖1G）。為了進(jìn)一步闡明DLL4+腫瘤細(xì)胞在THP治療耐藥中的因果作用，作者將小鼠4t1 - her2載體和4T1-HER2-DLL4細(xì)胞注射到BALB/c小鼠的脂肪墊中，然后用THP或?qū)φ瘴镏委煟▓D1H）。作者的研究結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，THP治療顯著減輕了腫瘤負(fù)擔(dān)，而在DLL4過(guò)表達(dá)（4T1-HER2-DLL4）組中，THP治療僅具有輕微的抗腫瘤作用（圖1I，J）。作者觀察到DLL4高的類器官比DLL4低的類器官具有更低的凋亡率和更高的IC50值（圖1K，L）。DLL4還能降低THP治療4T1腫瘤細(xì)胞的凋亡率（圖1M-O）。SKBR-3載體和SKBR3-OE細(xì)胞系的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這些發(fā)現(xiàn)支持DLL4+腫瘤細(xì)胞參與THP新輔助化療的耐藥。

為了進(jìn)一步闡明DLL4+腫瘤細(xì)胞在HER2+BC中誘導(dǎo)THP治療耐藥的機(jī)制，作者使用了來(lái)自小鼠HER2過(guò)表達(dá)乳腺腫瘤的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)（GSE166321）（圖2A-C）。GSEA在DLL4陽(yáng)性癌細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞(ES)/干細(xì)胞基因特征中顯著富集（圖2D）。因此，作者試圖研究DLL4+腫瘤細(xì)胞是否在HER2+ BC中表現(xiàn)出CSC特性，并與化療耐藥相關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)，與DLL4?腫瘤細(xì)胞相比，DLL4+腫瘤細(xì)胞形成更多的腫瘤球，ALDH1酶活性增加，CD44+CD24?腫瘤細(xì)胞比例更高（圖2E-J）。此外，3例患者的DLL4+腫瘤細(xì)胞中的信使RNA（mRNA）和干細(xì)胞相關(guān)基因（Sox9、Sox2、Oct4和Nanog）的蛋白水平也升高（圖2K-N）。此外，體內(nèi)有限稀釋實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DLL4+腫瘤細(xì)胞增加了腫瘤發(fā)病率（圖2O）。根據(jù)DLL4的基線表達(dá)，建立SKBR-3-OE、SKBR-3-KD、4T1-HER2-OE和BT474-KD細(xì)胞系。在DLL4下調(diào)或上調(diào)后的BT474、4T1-HER2和SKBR-3細(xì)胞系中也觀察到一致的結(jié)果，強(qiáng)調(diào)了DLL4在維持BC中CSC表型中的關(guān)鍵作用。

作者進(jìn)一步詢問(wèn)DLL4是否以Notch通路依賴的方式調(diào)節(jié)癌癥干細(xì)胞。Notch信號(hào)通路在DLL4+腫瘤細(xì)胞中被激活（圖2P-R）。此外，γ-分泌酶抑制劑MK-0752阻斷Notch通路后，DLL4+腫瘤細(xì)胞的球體形成能力、ALDH1酶活性和CD44+CD24?細(xì)胞比例均下降（圖2S-U）。MK-0752還逆轉(zhuǎn)了DLL4+腫瘤細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)（圖2V），突出了Notch信號(hào)在維持DLL4+腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞性中的關(guān)鍵作用。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，CSCs可能重塑腫瘤免疫微環(huán)境以增強(qiáng)免疫逃避?？紤]到與PCR組相比，NPCR組對(duì)免疫活性通路的負(fù)調(diào)控更為豐富，作者進(jìn)一步探討了DLL4是否可以重塑HER2+ BC的免疫景觀。因此，作者使用CIBERSORT方法對(duì)gene expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA bulk sequence基因表達(dá)數(shù)據(jù)37進(jìn)行反褶積，估計(jì)NPCR組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的多樣性和相關(guān)細(xì)胞組分，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的比例顯著降低（圖3A，B）。如圖3C、D所示，THP新輔助化療耐藥患者細(xì)針穿刺標(biāo)本中CD3+ T細(xì)胞總量減少，其中CD8+ T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞在化療耐藥患者中均減少（圖3E-H），說(shuō)明T細(xì)胞浸潤(rùn)在新輔助化療耐藥患者中受到限制。此外，作者發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的比例在高DLL4 +腫瘤細(xì)胞患者中都有所下降（圖3I，J，L，M）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，在高DLL4 +腫瘤細(xì)胞患者中，CD8+和CD4+ T細(xì)胞位于離腫瘤細(xì)胞更遠(yuǎn)的地方（圖3K，N）。與此一致的是，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了CD3+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞的比例在4T1-HER2-DLL4腫瘤中都有所下降。

為了進(jìn)一步評(píng)估DLL4是否通過(guò)減少t細(xì)胞浸潤(rùn)誘導(dǎo)化學(xué)耐藥，作者進(jìn)行了體內(nèi)t細(xì)胞缺失實(shí)驗(yàn)。如圖3O、Q所示，CD3+ t細(xì)胞缺失可以減弱DLL4在THP治療耐藥中的作用。更重要的是，在CD3+T細(xì)胞中，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞都參與了DLL4誘導(dǎo)的治療耐藥，但CD8+T細(xì)胞起主導(dǎo)作用。綜上所述，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)DLL4可以重新連接腫瘤免疫微環(huán)境，并與限制t細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，從而增強(qiáng)腫瘤對(duì)THP治療的抵抗力。

為了進(jìn)一步研究DLL4對(duì)免疫微環(huán)境的影響并闡明HER2+ BC中t細(xì)胞排斥的機(jī)制，作者分析了RNA批量測(cè)序數(shù)據(jù)，并觀察到在DLL4高表達(dá)的腫瘤中髓細(xì)胞群，特別是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的顯著增加（圖4A）。然而，在作者的隊(duì)列患者中，作者沒(méi)有觀察到新輔助化療耐藥患者或DLL4+腫瘤細(xì)胞水平高的患者中巨噬細(xì)胞（包括M1和M2）或樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）群體的明顯改變。然而，在新輔助THP治療耐藥患者中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加。在高水平DLL4+腫瘤細(xì)胞的患者中觀察到一致的結(jié)果。此外，對(duì)細(xì)胞內(nèi)通訊網(wǎng)絡(luò)的分析顯示，DLL4+癌細(xì)胞與中性粒細(xì)胞之間的相互作用增強(qiáng)（圖4C，D），特別是在這種情況下Notch信號(hào)的激活（圖4E）。此外，作者發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與CD3+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖4F）。這些發(fā)現(xiàn)提示中性粒細(xì)胞與THP治療耐藥之間存在潛在關(guān)聯(lián)。

中性粒細(xì)胞作為先天免疫吞噬細(xì)胞，在免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，具有吞噬、脫粒和釋放nets等功能作者發(fā)現(xiàn)，在高DLL4+腫瘤細(xì)胞水平的患者中，總中性粒細(xì)胞和發(fā)生NETosis的中性粒細(xì)胞（MPO+中性粒細(xì)胞）水平增加（圖4G-H），MPO+細(xì)胞和DLL4+細(xì)胞之間呈正相關(guān)（圖4I）。然后分離原代小鼠中性粒細(xì)胞，與不同條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)（圖4J）。小鼠中性粒細(xì)胞對(duì)4T1-HER2-DLL4腫瘤細(xì)胞的上清液表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移反應(yīng)（圖4K-L），發(fā)生NETosis的中性粒細(xì)胞比例增加（圖4M-N）。使用人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系（HL-60）原代BC腫瘤細(xì)胞和SKBR-3腫瘤細(xì)胞的上清液也獲得了類似的結(jié)果。以上結(jié)果提示，DLL4過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞上清液可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和NETosis的形成。

為了進(jìn)一步確定DLL4+腫瘤細(xì)胞是否通過(guò)誘導(dǎo)HER2+ BC中NET的形成來(lái)限制T細(xì)胞浸潤(rùn)，作者用蛋白精氨酸脫亞胺酶4抑制劑GSK484處理荷瘤小鼠，該抑制劑可以抑制中性粒細(xì)胞NETosis，在不影響中性粒細(xì)胞數(shù)量的情況下顯著抑制NET的形成。此外，GSK484挽救了4T1-HER2-DLL4組的t細(xì)胞浸潤(rùn)。更重要的是，作者觀察到在THP加GSK484治療后，DLL4過(guò)表達(dá)組的腫瘤負(fù)荷顯著降低。綜上所述，DLL4+腫瘤細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)NET形成限制T細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步促進(jìn)HER2+ BC中THP治療抵抗。

作者進(jìn)一步研究了DLL4+腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)NET形成和浸潤(rùn)的機(jī)制。DLL4是一種由685個(gè)氨基酸組成的I型跨膜蛋白，其胞外信號(hào)域可從膜上脫落形成可溶性DLL4（sDLL4）但sDLL4是否可以直接與中性粒細(xì)胞相互作用并誘導(dǎo)NETosis仍然未知。為了解釋這一點(diǎn)，用重組小鼠DLL4（rmDLL4）處理原代小鼠中性粒細(xì)胞。結(jié)果顯示，rmDLL4處理后，中性粒細(xì)胞的遷移和NETosis水平均增加（圖5A-D）。NETosis關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的mRNA和蛋白水平也升高（圖5E-6H）。在SKBR-3細(xì)胞系中獲得了一致的結(jié)果。此外，sDLL4中和抗體可以逆轉(zhuǎn)小鼠中性粒細(xì)胞的遷移和NETosis的形成（圖5I-L），這表明sDLL4從DLL4+腫瘤細(xì)胞中脫落直接導(dǎo)致中性粒細(xì)胞募集和NET的形成。

sDLL4可以結(jié)合Notch受體，激活Notch信號(hào)通路，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。為了探索Notch信號(hào)通路在sDLL4誘導(dǎo)NETs形成過(guò)程中的作用，作者使用γ-分泌酶抑制劑MK-0752阻斷中性粒細(xì)胞中的Notch信號(hào)，MK-0752減弱rmDLL4誘導(dǎo)的遷移能力增強(qiáng)和NET形成（圖5M-P）。MK-0752處理后，原代小鼠中性粒細(xì)胞和HL-60中NETosis關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的mRNA和蛋白水平也降低（圖5Q-T），證實(shí)了Notch信號(hào)對(duì)這些酶的調(diào)節(jié)作用。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RBPJ具有基序，可以結(jié)合PDIA4、MPO和ELANE基因的啟動(dòng)子區(qū)域，rhDLL4進(jìn)一步增強(qiáng)RBPJ，促進(jìn)NEToisis相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

作者的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了DLL4+腫瘤細(xì)胞在THP新輔助化療耐藥中的重要作用，因此作者認(rèn)為消除該細(xì)胞亞群可能會(huì)潛在地使HER2+ BC對(duì)THP化療敏感。為了特異性根除DLL4+腫瘤細(xì)胞亞群，產(chǎn)生了靶向DLL4的CAR-T細(xì)胞（圖6A）。基于小鼠DLL4抗體的單鏈片段變量（scFV）序列，構(gòu)建了由IRES驅(qū)動(dòng)的小鼠DLL4靶向CAR。共培養(yǎng)24小時(shí)后，4T1-HER2-DLL4腫瘤細(xì)胞（DLL4高密度）在mDLL4 CAR-T中誘導(dǎo)的IFN-γ和IL-2分泌量遠(yuǎn)高于4T1-HER2載體腫瘤細(xì)胞（圖6B，C），這表明DLL4表達(dá)是CAR-T效應(yīng)功能的驅(qū)動(dòng)因素。與NTD相比，DLL4-CAR-T細(xì)胞在廣泛的效應(yīng)細(xì)胞：腫瘤細(xì)胞（E:T）比率（圖6D）上對(duì)4T1-HER2-DLL4腫瘤細(xì)胞顯示出強(qiáng)大的裂解功能，證實(shí)了作者設(shè)計(jì)的DLL4靶向CAR-T細(xì)胞的可用性。

此外，與單獨(dú)THP治療相比，DLL4-CAR-T細(xì)胞和THP聯(lián)合化療顯著增加了DLL4高類器官和THP耐藥類器官的凋亡率（圖6E-G）。此外，作者還建立了THP耐藥小鼠MMTV-Neu腫瘤細(xì)胞系（THPR腫瘤細(xì)胞）。與此一致的是，THPR腫瘤細(xì)胞通過(guò)DLL4保持干性并誘導(dǎo)NETosis。作者發(fā)現(xiàn)，DLL4靶向CAR-T細(xì)胞也表現(xiàn)出對(duì)THPR細(xì)胞系的有效殺傷能力，逆轉(zhuǎn)了其THP治療抵抗模式。這些結(jié)果表明，DLL4靶向CAR-T細(xì)胞可以使THP化療在耐藥的HER2+ BC腫瘤中變得脆弱。

此外，作者還研究了DLL4靶向CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞毒功能（圖6H）。結(jié)果顯示，在4T1-HER2-DLL4荷瘤（圖6I）或THPR荷瘤受體小鼠中，DLL4 CAR-T細(xì)胞的額外治療顯著逆轉(zhuǎn)了THP化療的耐藥性，并伴有免疫微環(huán)境的重塑（圖6J-L）。結(jié)果表明，DLL4靶向CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)thp耐藥樣品具有有效的細(xì)胞毒功能。此外，作者在體內(nèi)和體外均發(fā)現(xiàn)抗DLL4 CAR-T在THP耐藥腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出比抗HER2 CAR-T更強(qiáng)的殺瘤活性，這可能是由于HER2在THP耐藥腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)較低。這些結(jié)果表明，抗DLL4 CAR-T對(duì)THP耐藥的HER2+ BC具有更精確和特異性的靶向能力。

為了檢測(cè)DLL4 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的長(zhǎng)期抗腫瘤效果，作者在第7天、第14天、第21天、第28天收集每只小鼠的外周血單個(gè)核細(xì)胞。如圖6M-O所示，抗DLL4 -CAR-T治療組在第28天血清中EGFP+CAR-T細(xì)胞比例和IFN-γ或IL-2水平仍保持較高水平。同樣，CAR-T細(xì)胞在腫瘤中的比例仍然保持在較高水平（圖6P）?？?/span>DLL4 CAR-T療法的安全性是可以接受的?？偟膩?lái)說(shuō)，作者的數(shù)據(jù)表明，通過(guò)DLL4 CAR-T細(xì)胞根除DLL4+腫瘤細(xì)胞可以使HER2+ BC的化療增敏，具有長(zhǎng)期的抗腫瘤作用和安全性。

作者的研究結(jié)果首先表明，DLL4通過(guò)雙重機(jī)制參與了HER2+ BC中腫瘤細(xì)胞干性增強(qiáng)和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少的THP耐藥的新輔助治療?？梢韵胂螅?/span>HER2+ BC中，DLL4靶向治療的進(jìn)一步臨床翻譯可以降低腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞性，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并對(duì)雙重HER2阻斷治療的效果敏感。

基因表達(dá)分析、RNA測(cè)序數(shù)據(jù)反褶積、基因拷貝數(shù)變異分析、基因富集分析、KEGG和GO分析、候選基因庫(kù)交叉分析、染色質(zhì)免疫沉淀、多重免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、成球?qū)嶒?yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染、藥物處理實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)、CAR-T細(xì)胞制備與共培養(yǎng)、腫瘤移植模型、IHC染色、長(zhǎng)期抗腫瘤效果評(píng)估