骨髓基質(zhì)細胞（BMSCs）對于防止多發(fā)性骨髓瘤（MM）細胞因化療誘導的凋亡至關(guān)重要，但其在他形式細胞死亡中的作用和機制尚未得到充分闡明。在這里，我們使用體外BMSC-MM相互作用模型觀察到，BMSCs通過提高谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的水平，保護MM細胞免受不穩(wěn)定鐵池（LIP）和活性氧（ROS）觸發(fā)的鐵死亡。從機制上講，BMSCs的直接相互作用通過CD40/CD40L信號通路在MM細胞中上調(diào)了SUMO特異性蛋白酶3（SENP3）的表達，并且SENP3在賴氨酸75殘基處解除了SUMO2的共價連接，從而穩(wěn)定了GPX4蛋白，通過消耗ROS來消除Vk*MYC小鼠模型中的MM細胞以及在Cd40lfl/fl;Prx1Cre/+小鼠（CD40-CKO）和Sumo2敲除（SUMO2-KO）小鼠中分離出的CD138+B220-細胞的鐵死亡。我們還驗證了靶向SENP3增強了GPX4抑制劑RSL3的殺傷效果，從而減少了腫瘤負擔，延長了小鼠的生存期，并減輕了攜帶MM腫瘤的小鼠的骨骼破壞。我們的研究解析了BMSCs防止MM細胞自發(fā)鐵死亡的機制，并明確了非凋亡策略在管理難治性或復發(fā)性MM患者中的治療潛力。本文于2024年12月發(fā)表于“Cancer Lett”（IF=9.1）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）BMSCs上調(diào)GPX4以消除MM細胞中的鐵死亡

我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，與BMSCs的直接相互作用提高了MM細胞中的鐵水平，而不穩(wěn)定鐵池（LIP），一種含有氧化還原活性鐵復合物的池，可以通過直接產(chǎn)生ROS來觸發(fā)鐵死亡，但我們沒有在MM細胞中檢測到鐵死亡。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)與BMSCs共培養(yǎng)提高了MM細胞中LIP的積累（圖1a），然而ROS水平相對較低（圖1b和c）。因此，我們使用與單克隆抗人CD138抗體結(jié)合的微珠（圖1d）對BMSCs-MM相互作用系統(tǒng)中的MM細胞進行了蛋白質(zhì)組學分析，并鑒定了387個差異表達蛋白（DEP），包括234個上調(diào)和153個下調(diào)的蛋白（圖1e）。在所有上調(diào)蛋白中，GPX4和FTH1被列為變化最大的蛋白，以及轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFRC）（圖1f）。有趣的是，KEGG分析顯示，這些DEP在調(diào)節(jié)鐵死亡、礦物質(zhì)吸收、不飽和脂肪酸（UFA）和脂肪酸延長方面富集（圖1g）。我們驗證了GPX4和FTH1的蛋白水平在BMSC相互作用的MM細胞中都有顯著升高（圖1h）。值得注意的是，對臨床隊列GSE4500和GSE9782的分析表明，GPX4的表達從骨髓漿細胞（BMPC）階段逐漸增加到單克隆丙種球蛋白病不確定意義（MGUS）和冒煙型多發(fā)性骨髓瘤（SMM）的狀態(tài)（圖1i）。此外，較高的GPX4水平預(yù)示著對治療的反應(yīng)較差（圖1j），以及GSE4581和GSE9782隊列中MM患者的臨床結(jié)果較差（圖1k和l）。這些結(jié)果表明，BMSCs上調(diào)GPX4水平以促進MM細胞的存活。

2）SENP3與GPX4相互作用穩(wěn)定GPX4

迄今為止的結(jié)果表明，升高的GPX4是保護共培養(yǎng)MM細胞免受鐵死亡的關(guān)鍵因素，然后我們試圖解碼GPX4上調(diào)的機制。我們進行了免疫沉淀和質(zhì)譜分析，并確定SUMO特異性肽酶3（SENP3）在共培養(yǎng)的MM.1S細胞中flag標記的GPX4蛋白的相互作用組中富集（圖2a），并且在MM細胞的細胞質(zhì)和細胞核中檢測到GPX4和SENP3的共定位（圖2b）。此外，通過共免疫沉淀（Co-IP）實驗驗證了內(nèi)源性和外源性相互作用（圖2c和d）。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接實驗預(yù)測了SENP3和GPX4之間的直接相互作用（圖2e），其體外直接相互作用通過GST下拉實驗得到驗證（圖2f）。同時，當SENP3在MM細胞中過表達時，GPX4蛋白顯著上調(diào)（圖2g），然而敲減SENP3明顯抑制了GPX4水平（圖2h）。為了評估SENP3對體內(nèi)GPX4蛋白的影響，我們通過將Gpx4-floxp小鼠與Cd19-Cre刪除小鼠雜交，構(gòu)建了B細胞條件性敲除SENP3敲除（CKO）小鼠。正如預(yù)期的那樣，與Senp3fl/fl;WT對照組相比，Senp3的耗竭明顯抑制了來自Senp3fl/fl; Cd19-cre小鼠的B細胞中GPX4蛋白水平（圖2i）。以上所有結(jié)果都表明SENP3通過直接相互作用穩(wěn)定GPX4。

3）GPX4的降解依賴于SUMO2

由于SENP3調(diào)節(jié)核糖體成熟，我們進一步評估了GPX4蛋白如何在翻譯后進行修飾。在SENP3過表達（SENP3-OE）的MM細胞中，GPX4增加（圖3a），而在SENP3敲減（SENP3-KD）的MM細胞中GPX4減少（圖3b），而SENP3未能改變GPX4的mRNA水平（圖3c）。考慮到SENP3是一種SUMO特異性酶，我們接下來分析了哪種SUMO分子，包括SUMO1、SUMO2和SUMO3，在GPX4的SUMO化中占主導地位。有趣的是，盡管GPX4可以被所有SUMOs修飾，但與另外兩種相比，SUMO2在修飾GPX4方面更為主導（圖3d）。SUMO2的過表達，而不是SUMO1或SUMO3，以劑量依賴性的方式抑制了GPX4水平（圖3e，f，3g）。重要的是，SUMO2對GXP4的影響可以通過蛋白酶體抑制劑MG132消除（圖3h）。為了評估SUMO2對體內(nèi)GPX4蛋白的影響，我們構(gòu)建了Sumo2敲除小鼠（Sumo2-KO）。正如預(yù)期的那樣，在Sumo2-/- B淋巴細胞中，GPX4水平顯著升高（圖3i和j）。這些結(jié)果表明SUMO2介導了GPX4的降解。

4）SENP3在K75處使GPX4的SUMO2脫偶聯(lián)

接下來，我們試圖探索GPX4蛋白上的SUMO化修飾位點。正如預(yù)期的那樣，在SENP3-KD MM細胞中，由SUMO2修飾的內(nèi)源性GPX4的SUMO化水平顯著增加（圖4a），而SENP3的過表達減輕了由SUMO2修飾的內(nèi)源性GPX4的SUMO化水平（圖4b），并通過消除SUMO2的共價結(jié)合來挽救GPX4的抑制（圖4c和d）。在預(yù)測GPX4蛋白的氨基酸序列時，我們發(fā)現(xiàn)K11、K75、K107、K117和K126殘基是潛在的SUMO化位點（圖4e）。所有這些賴氨酸殘基似乎都可以被SUMO2共價結(jié)合（圖4f），但只有K75共價結(jié)合的SUMO2介導的SUMO化對GPX4蛋白產(chǎn)生了最大的修飾效果（圖4g），證據(jù)表明當GXP4蛋白上的第75位賴氨酸突變?yōu)榫彼釙r，SUMO2的過表達無法降解底物（圖4h）。以上所有結(jié)果表明，SENP3通過SUMO化修飾從GPX4蛋白的K75位點上解除了SUMO2的共價結(jié)合，從而穩(wěn)定了GPX4。

5）SENP3與MM的臨床進展相關(guān)

在多發(fā)性骨髓瘤（MM）的進展過程中，我們分析了獨立隊列GSE9782和GSE2113，并觀察到SENP3的表達從骨髓漿細胞（BMPC）階段逐漸增加到單克隆丙種球蛋白病不確定意義（MGUS）和冒煙型多發(fā)性骨髓瘤（SMM）的狀態(tài)（圖5a），在活動性多發(fā)性骨髓瘤中甚至更高（圖5b）。我們MM隊列的臨床樣本進一步證實了SENP3表達與骨病變數(shù)量之間的正相關(guān)關(guān)系（圖5c）。此外，與初診樣本相比，接受基于硼替佐米方案治療的RRMM患者中分離的CD138+漿細胞中SENP3和GPX4的蛋白水平都有所增加（圖5d），且這兩種蛋白之間存在顯著的正相關(guān)（圖5e）。值得注意的是，通過免疫組化（IHC）也發(fā)現(xiàn)了SENP3和GPX4的上調(diào)（圖5f，g，5h）。與對照相比，SENP3表達缺陷的MM細胞對硼替佐米治療更為敏感（圖5i）。同時，GSE4581和GSE9782隊列中MM患者SENP3較高的表達水平與較差的總生存期相關(guān)（圖5j和k），以及GEO、EGA和TCGA數(shù)據(jù)庫的綜合Kaplan-Meier Plotter分析也顯示這一點（圖5l）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明SENP3表達與臨床上MM的疾病進展密切相關(guān)。

6）CD40/CD40L 橋接BMSCs和MM之間的相互作用以調(diào)控SENP3表達

我們進一步建立了體外和體內(nèi)模型來闡明BMSCs如何調(diào)節(jié)SENP3表達。在兩個BMSC-MM相互作用的共培養(yǎng)系統(tǒng)（圖6a）中，僅在細胞-細胞接觸條件下，我們觀察到GPX4和SENP3的蛋白水平顯著增加（圖6b），GPX4的SUMO化減少了（圖6c），而GPX4的mRNA水平?jīng)]有檢測到變化（圖6d）。使用VkMYC小鼠MM模型（圖6e），我們觀察到與來自外周血或脾臟的細胞相比，來自骨髓的CD138+B220-細胞中GPX4和SENP3的水平明顯更高（圖6f），這表明直接相互作用方式起著決定性作用。接下來，我們探索了哪種細胞粘附分子介導BMSCs和MM細胞之間的相互作用。根據(jù)之前的報告，我們分別刪除了MM細胞上的三個主要分子，包括VLA-4、MUC1和CD40，并發(fā)現(xiàn)只有CD40的耗竭，而不是VLA-4或MUC1，在細胞-細胞接觸模型中未能上調(diào)GPX4或SENP3水平（圖6g），并且BMSCs中CD40-KD未能減少MM細胞中由SUMO2介導的GPX4蛋白的SUMO化（圖6h）。此外，在細胞-細胞接觸系統(tǒng)中使用抗CD40中和抗體抵消了BMSC誘導的GPX4和SENP3水平的增加（圖6i），加劇了由SUMO2介導的GPX4的SUMO化（圖6j）。同樣，當BMSCs中CD40L耗竭時，共培養(yǎng)的MM細胞中GPX4和SENP3水平幾乎沒有增加（圖6k），GPX4的SUMO化明顯加?。▓D6l）。與Cd40lfl/fl;WT小鼠相比，來自骨髓的CD138+B220-細胞中GPX4和SENP3受到顯著抑制（圖6m和n）。這些結(jié)果表明，CD40-CD40L途徑是BMSCs和MM細胞之間上調(diào)MM細胞中SENP3的關(guān)鍵橋梁，從而穩(wěn)定GPX4以消耗ROS。

7）SENP3促進MM細胞對鐵死亡的抵抗

由于GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，我們接下來討論SENP3在觸發(fā)鐵死亡中的作用。如預(yù)期的那樣，當SENP3被耗竭時，MM細胞中ROS明顯積累（圖7a和b），并且SENP3的耗竭導致對GPX4抑制劑的敏感性增加（圖7c），因為與對照細胞相比，RSL3顯著誘導了更多的MM細胞死亡（圖7d）。然而，當鐵死亡被鐵螯合劑DFO或鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）阻斷時，SENP3對RSL3誘導的鐵死亡的防護作用被無效化（圖7e）。為了定義SENP3在體內(nèi)調(diào)節(jié)鐵死亡的作用，我們使用SENP3-KD和對照MM.1S細胞構(gòu)建了NSG小鼠基于異種移植和骨髓內(nèi)MM生長的小鼠模型（圖7f）。在異種移植模型中，當SENP3被抑制時，RSL3表現(xiàn)出顯著的抗MM效果（圖7g），并且SENP3-KD組的小鼠總體生存率顯著延長（圖7h）；在骨髓內(nèi)小鼠模型中，用RSL3治療的SNEP3-KD細胞攜帶的小鼠骨髓中的腫瘤負擔顯著減少（圖7i），并且骨病變明顯緩解（圖7j），這也通過骨小梁的三維重建測量得到了證實（圖7k），以及包括 BV/TV百分比更高、皮質(zhì)厚度更大、小梁數(shù)量更多以及遠端和骨干小梁分離尺寸更小的定量分析（圖7l）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)強烈表明SENP3促進了MM細胞對鐵死亡的抵抗。

結(jié)論：

骨髓基質(zhì)細胞通過CD40/CD40L信號通路在多發(fā)性骨髓瘤細胞中上調(diào)SENP3，并且SENP3將SUMO2從GPX4的K75位點解離，以穩(wěn)定GPX4，從而防止骨髓間充質(zhì)干細胞與MM細胞相互作用導致鐵代謝引發(fā)鐵死亡。我們的研究揭示了SENP3在調(diào)節(jié)鐵死亡中的作用，并為臨床治療復發(fā)性難治性多發(fā)性骨髓瘤提供了新的治療策略。

實驗方法：

KEGG通路分析、臨床隊列分析、Kaplan-Meier生存分析、蛋白質(zhì)組學分析、Real-time PCR、Western Blotting、免疫沉淀和質(zhì)譜分析、GST-pulldown實驗、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接實驗、細胞培養(yǎng)與共培養(yǎng)、流式細胞術(shù)、CCK-8實驗、免疫共沉淀（Co-IP）實驗、基因敲除與過表達、鐵死亡誘導實驗、異種移植模型、骨髓內(nèi)模型、基因敲除小鼠模型、通過免疫組化

參考文獻：

Jiang H, Li Q, Yang X, Jia L, Cheng H, Wang J, Wang S, Li X, Xie Y, Wang J, Wang Y, Hu M, Guo J, Peng Z, Wang M, Li T, Zhao H, Wang L, Liu Z. Bone marrow stromal cells protect myeloma cells from ferroptosis through GPX4 deSUMOylation. Cancer Lett. 2024 Dec 7;611:217388. doi: 10.1016/j.canlet.2024.217388.