在肝細胞癌（HCC）轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中，除了經(jīng)典特征外，是否還存在其他新的病理特征尚不清楚。我們之前的研究強調(diào)了基質(zhì)硬度增加對肝細胞癌肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成和轉(zhuǎn)移的貢獻。然而，基質(zhì)剛性增加是否影響糖代謝和肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的供應仍不清楚。在這里，我們揭示了基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)外泌體miRNA作為主要貢獻者在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中通過減少肺成纖維細胞的葡萄糖攝取和消耗以及增加血管生成和血管通透性來調(diào)節(jié)葡萄糖富集的潛在機制。我們的研究結(jié)果表明，由基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)的外泌體miRNA觸發(fā)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的新特征葡萄糖富集對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的定植和存活以及隨后的轉(zhuǎn)移灶生長至關重要。該文章于2025年2月發(fā)表在《Nature Communication》，IF：14.1。

參考本研究課題組先前報道的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動物模型的誘導方法，我們開發(fā)了另一種無瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位模型，以評估高剛度刺激下HCC細胞條件培養(yǎng)基對肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成的貢獻。如圖1a的動物實驗示意圖所示，我們分別從生長在6 kPa和16 kPa底物上的Hepa1-6細胞（命名為L-CM和H-CM）中收集條件培養(yǎng)基（CM），每隔一天通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)（C57BL/6），誘導具有肺轉(zhuǎn)移前壁龕的無瘤小鼠模型。注射的L-CM和H-CM分別代表正常肝臟和肝硬化背景的HCC腫瘤釋放的可溶性因子。考慮到BMDCs募集是肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位最突出的特征之一，我們通過流式細胞術評估了不同誘導時間點新鮮肺組織中CD11b+CD45+ BMDCs的募集水平。隨著誘導天數(shù)的延長，L-CM組和H-CM組CD11b+CD45+ BMDCs的數(shù)量均增加。同時，與L-CM組相比，H-CM組在第18、22、26天CD11b+CD45+ BMDCs的募集水平均有所增強，其中第26天BMDCs募集差異最大（圖1b、c）。以上結(jié)果提示，H-CM可能對HCC肺轉(zhuǎn)移前小環(huán)境的形成具有較強的誘導能力。此外，它們使我們能夠初步確定第26天的誘導時間點作為成功形成具有肺轉(zhuǎn)移前壁龕的無腫瘤小鼠模型的日子。我們進一步分析了這些動物模型第26天新鮮肺組織中轉(zhuǎn)移前生態(tài)位相關基因（Fn、Mmp9、S100a8、S100a9、Bv8）的表達情況，發(fā)現(xiàn)H-CM組轉(zhuǎn)移前生態(tài)位相關基因的表達水平均顯著高于L-CM組（圖1d），這與H-CM組BMDCs募集結(jié)果一致。同樣，我們也觀察到纖維連接蛋白（FN）的表達（圖1e）和髓源性抑制細胞（MDSCs）的比例（圖1f）明顯增加，以及H-CM組中效應CD8+ T細胞比例的顯著降低（圖1g），證實H-CM確實促進了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。此外，我們還在第26天檢測了肺組織血管密度和通透性的分子標記，結(jié)果顯示，H-CM組CD31表達明顯增加，但CD31+區(qū)域VE-cadherin覆蓋率明顯降低（圖1h，i），說明H-CM具有更強的促進血管生成和破壞血管完整性的能力?；趦山M在BMDCs募集、基質(zhì)重塑（FN和MMP9）、免疫抑制（MDSCs和CD8+ T細胞）、血管生成和血管滲透（BV8、CD31和VE-cadherin）以及炎癥（S100A8和S100A9）方面的顯著差異，我們得出結(jié)論，與L-CM相比，H-CM顯著加速了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。

除了上述體內(nèi)研究結(jié)果外，我們隨后在體外構建了一種反映病理狀態(tài)下肺組織硬度的凝膠底物（926.18 Pa，肺硬度底物）來培養(yǎng)常駐細胞，然后使用H-CM對這些細胞進行干預，以模擬體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位環(huán)境。我們將6 kPa和16 kPa硬度底物培養(yǎng)的人肝癌細胞的L-CM和H-CM分別用于肺硬度底物培養(yǎng)的肺成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)與L-CM干預相比，H-CM干預顯著上調(diào)肺成纖維細胞中FN和MMP9的蛋白水平（圖1j），與動物實驗結(jié)果一致（圖1d）。同時，我們觀察到H-CM處理后肺成纖維細胞單層表面貼壁的HCC細胞數(shù)量明顯增加（圖1k）。這些結(jié)果有力地支持了H-CM通過影響肺成纖維細胞和創(chuàng)造適合腫瘤細胞粘附的土壤在肺基質(zhì)重塑中的突出作用。另一方面，我們還評估了H-CM對血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）中VEGFR2、ZO-1和VE-cadherin表達的影響，結(jié)果顯示，H-CM顯著提高了VEGFR2的表達，抑制了ZO-1和VE-cadherin的表達（圖1l），這表明H-CM具有更強的促進血管生成和損傷血管完整性的誘導能力，這與動物模型的研究結(jié)果一致（圖1i）。經(jīng)H-CM處理的HUVEC單層也顯示出對FITC-葡聚糖的血管通透性增加（圖1m），驗證了H-CM可以通過培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞明顯增加血管通透性?？傊w內(nèi)和體外證據(jù)充分表明，HCC細胞在高剛度刺激下釋放的條件培養(yǎng)基顯著促進肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。

轉(zhuǎn)移靶器官中的常駐細胞（成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等）受到腫瘤衍生的可溶性因子的教育，通常參與重塑循環(huán)腫瘤細胞定植和存活的有利“土壤”環(huán)境。我們之前的研究也表明，HCC細胞在高剛度刺激下分泌的LOXL2可以誘導肺成纖維細胞并招募BMDCs，從而促進肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。葡萄糖作為主要的營養(yǎng)物質(zhì)，主要滿足腫瘤細胞增殖和存活的能量需求，重編程的葡萄糖代謝也被認為是癌癥的一個典型特征。肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位屬于HCC細胞的異位生存部位。轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的葡萄糖富集可能對支持播散性腫瘤細胞的異位定植、存活和生長至關重要。因此，除了BMDCs募集、基質(zhì)重塑、免疫抑制、炎癥、血管生成和血管通透性等經(jīng)典病理變化外，我們推測葡萄糖代謝重編程也可能發(fā)生在轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成過程中。為了研究高剛度刺激下HCC細胞釋放的條件培養(yǎng)基是否調(diào)節(jié)肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中常駐細胞的葡萄糖代謝，我們參照肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位環(huán)境構建了上述相同的實驗系統(tǒng)，評估葡萄糖轉(zhuǎn)運體和糖酵解酶在常駐間質(zhì)細胞中的表達變化。結(jié)果表明，H-CM干預顯著降低了肺成纖維細胞中GLUT1、PFKP、PKM2和HK2的表達，但對SGLT2的表達影響不大（圖2a），說明肺成纖維細胞的糖攝取和糖代謝水平均被嚴重削弱。與此一致的是，2-NBDG攝取和葡萄糖消耗實驗也顯示，經(jīng)H-CM處理的肺成纖維細胞的葡萄糖攝取和消耗明顯減少（圖2b，c）。隨后，我們進行了非靶向代謝組學分析，以進一步闡明H-CM對肺成纖維細胞代謝改變的影響，發(fā)現(xiàn)H-CM干預導致細胞內(nèi)糖酵解代謝物（包括葡萄糖6-磷酸）含量顯著降低，果糖-6-磷酸、2-磷酸- d -甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸，這些差異代謝物也在中心碳代謝途徑中富集（圖2d）。以上數(shù)據(jù)均支持H-CM干預有效減弱肺成纖維細胞的葡萄糖攝取和消耗，從而創(chuàng)造一個富含葡萄糖的微環(huán)境。為了進一步驗證這一發(fā)現(xiàn)，我們繼續(xù)檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖酵解酶在具有肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的無腫瘤小鼠模型新鮮肺組織中的表達變化。我們的結(jié)果還顯示，除了Slc5a2（SGLT2的基因名稱）外，糖酵解酶（Pfkp，Pkm和Hk2）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（Slc2a1）的表達水平在H-CM組均顯著降低（圖2e）。同時，在肺組織水平上，GLUT1的低表達和糖原含量的增加（圖2f）也支持了H-CM組糖代謝水平的顯著降低和葡萄糖積累的增加。此外，通過培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞，H-CM誘導的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的血管通透性和血管生成得到改善（圖11，m）也表明肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的葡萄糖供應和聚集增加。這些數(shù)據(jù)表明，在H-CM誘導的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中存在葡萄糖富集的新特征。

為了確定葡萄糖富集是肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的新特征，闡明其病理意義是必不可少的。基于葡萄糖富集有利于提高HCC細胞粘附能力的結(jié)果（圖2g），并且MDSCs的積累可能部分歸因于MDSC分化的增加（圖1f），我們合理推測，轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的葡萄糖富集可能會影響粘附分子的表達，從而促進HCC細胞的粘附，或者增強周圍的免疫抑制強度，從而促進其生存和轉(zhuǎn)移。我們重點研究了一種粘附分子，整合素β1，它可以結(jié)合基質(zhì)細胞產(chǎn)生的纖維連接蛋白，并探討了高糖上調(diào)整合素β1表達的潛在機制。AMPK是細胞能量傳感器的關鍵調(diào)節(jié)因子，據(jù)報道，在癌細胞、成肌細胞和足細胞中，AMPK受到高葡萄糖的負調(diào)控。為了進一步確定高糖誘導的整合素β1上調(diào)是否參與了HCC細胞對肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的粘附，我們使用AMPK激動劑（A-769662）或整合素β1功能阻斷抗體（整合素β1 Ab）治療HCC細胞，觀察其粘附變化。結(jié)果顯示，激活AMPK或阻斷整合素β1可明顯抑制肝細胞在肺成纖維細胞單層上的粘附（圖2h）。因此，肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中葡萄糖富集可通過調(diào)節(jié)AMPKα/SNX17通路，有效上調(diào)HCC細胞表面整合素β1水平，從而促進腫瘤細胞對轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的粘附。除了細胞粘附特性外，肺轉(zhuǎn)移前壁龕中MDSCs的數(shù)量對于循環(huán)腫瘤細胞在外源組織中的定植和存活也至關重要。在具有肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的無腫瘤小鼠模型中，我們驗證了H-CM在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中MDSCs積累中的重要作用（圖1f）。考慮到MDSCs的積累可能部分歸因于MDSC分化的增加，我們繼續(xù)澄清葡萄糖富集是否影響MDSCs分化。在IL-6和GM-CSF存在下，高糖顯著促進骨髓細胞向MDSCs分化，而糖酵解抑制劑（2-DG）干預顯著減弱其對MDSCs分化的影響（圖2i）。在之前的報道中，mTOR通路的激活可能參與了葡萄糖積累對MDSCs分化和功能的影響。在這里，我們還觀察到MDSCs在高糖刺激下mTOR磷酸化水平的增加，但2-DG干預有效地抑制了這種作用（圖2j）。總之，轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中的葡萄糖富集通過AMPKα/SNX17途徑顯著上調(diào)整合素β1的表達，促進HCC細胞對生態(tài)位的粘附，也增加了MDSCs的分化，加強了免疫抑制微環(huán)境，從而促進了隨后的定植和生存，這表明葡萄糖富集是肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的一個新特征。

原發(fā)性腫瘤釋放的可溶性因子通常包含分泌蛋白、細胞外囊泡（EVs）和其他分子元件。外泌體作為分泌的微泡可以從腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到受體細胞中，實現(xiàn)細胞間的信息交換?？紤]到葡萄糖代謝重編程發(fā)生在細胞內(nèi)，腫瘤細胞來源的外泌體可能在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中調(diào)節(jié)葡萄糖富集發(fā)揮主導作用。我們用差示超離心的方法從H-CM制備了無外泌體的H-CM（H-CM- exo -free），并通過分析外泌體標記包括TSG101、CD63、Hsp70和ALIX來證實其質(zhì)量。然后，我們分別利用無H-CM- exo和H-CM處理生長在肺堅硬底物上的肺成纖維細胞，結(jié)果表明，無H-CM- exo干預顯著逆轉(zhuǎn)了H-CM干預對糖酵解酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的影響（圖2k），以及葡萄糖攝取和消耗（圖2l，m）。這些數(shù)據(jù)表明，在H-CM誘導的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位期間，外泌體確實是調(diào)節(jié)葡萄糖富集的主要因素。

為了進一步驗證外泌體在H-CM誘導的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位中調(diào)控葡萄糖富集的主導作用，我們采用差分超離心法從L-CM和H-CM中純化外泌體，分別命名為L-Exo和H-Exo。純化的外泌體呈現(xiàn)典型的杯狀結(jié)構（圖3a），符合外泌體的典型表型特征。此外，它們的分子標記TSG101、CD63、Hsp70、ALIX均檢測到，而陰性分子標記Albumin、Cytochrome C均未檢測到（圖3b），進一步證實純化的外泌體質(zhì)量符合外泌體的特性，可用于下游實驗。我們隨后使用膜綠色熒光探針（DIO）標記L-Exo或H-Exo來確定受體細胞，發(fā)現(xiàn)在DIO標記的外泌體孵卵后，受體細胞（肺成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞）都有細胞內(nèi)的綠色斑點（圖3c），表明來自HCC細胞的L-Exo和H-Exo可以成功轉(zhuǎn)移到肺成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞中。由于腫瘤細胞分泌的外泌體動員BMDCs進入次要器官部位，觸發(fā)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成，我們利用Millicell懸掛細胞培養(yǎng)插入物構建了模擬轉(zhuǎn)移前生態(tài)位環(huán)境的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)（圖3d），以闡明外泌體在轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成中的作用。具體來說，BMCs在IL-6和GM-CSF存在下在下腔培養(yǎng)48小時，然后與在肺硬度底物上生長的L-Exo或h-exo處理的肺成纖維細胞在上腔共培養(yǎng)48小時。我們觀察到，與L-Exo干預相比，H-Exo干預顯著提高了肺成纖維細胞中FN和MMP9的表達，而與BMCs共培養(yǎng)進一步增強了這些作用（圖3d）。同時，當BMCs與h-exo處理的肺成纖維細胞共培養(yǎng)時，BMCs向MDSCs分化的數(shù)量顯著增加（圖3e）。H-Exo干預與H-CM干預在體內(nèi)的結(jié)果基本一致，說明H-Exo與H-CM類似，也促進了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。使用L-Exo或H-Exo處理生長在肺僵硬底物上的肺成纖維細胞，我們進一步檢測糖酵解相關蛋白的表達和肺成纖維細胞的葡萄糖攝取能力，以驗證它們在葡萄糖代謝中的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，H-Exo干預顯著降低了肺成纖維細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT1）和糖酵解酶（PFKP、PKM2和HK2）的基因和蛋白表達水平。此外，H-Exo處理也削弱了它們的葡萄糖攝取和消耗能力，與H-CM干預的結(jié)果一致（圖2a-c），證實了外泌體在葡萄糖代謝中的調(diào)節(jié)作用。同時，我們發(fā)現(xiàn)H-Exo培養(yǎng)的肺成纖維細胞單層表面粘附的HCC細胞數(shù)量增加，表明H-Exo通過重塑基質(zhì)和促進葡萄糖富集，為CTC的粘附和定植創(chuàng)造了有利的“土壤”環(huán)境。這意味著H-Exo干預通過改變血管通透性和血管生成，增加了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的葡萄糖供應和聚集。

為了進一步驗證H-Exo對肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成，特別是葡萄糖富集的貢獻，我們在體內(nèi)建立了H-Exo誘導的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位無腫瘤小鼠模型。與圖1a所描述的方法類似，我們每隔一天通過尾靜脈分別向C57BL/6小鼠體內(nèi)注射L-Exo和H-Exo，誘導肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成（圖3f）。在誘導外泌體的第26天，我們收集新鮮肺組織進行后續(xù)分析。與H-CM誘導相同，H-Exo誘導也顯著促進肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成，包括增加CD11b+CD45+ BMDCs的募集，誘導基質(zhì)重塑，促進肺組織血管生成和炎癥（圖3g）。我們從游離的肺組織中分離并收集了間質(zhì)部分液，并檢測了無細胞間質(zhì)部分液中的葡萄糖水平。結(jié)果顯示，H-Exo誘導小鼠肺組織間質(zhì)葡萄糖含量高于L-Exo誘導小鼠肺組織間質(zhì)葡萄糖含量（圖3h），表明H-Exo誘導的肺轉(zhuǎn)移前壁龕中形成了葡萄糖富集。此外，對外泌體標志物TSG101、成纖維細胞標志物S100A4（FSP-1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1的多重免疫熒光分析顯示，h-exo誘導組肺成纖維細胞接受外泌體，其外泌體集中區(qū)域的葡萄糖攝?。?/span>GLUT1表達）明顯降低。此外，H-Exo誘導還通過抑制cd31陽性血管內(nèi)皮細胞中VE-cadherin的表達來增加血管通透性（圖3i），這表明H-Exo增加了葡萄糖供應和聚集。我們繼續(xù)將Hepa1-6-Luc細胞靜脈注射到已建立的動物模型體內(nèi)（圖3f），發(fā)現(xiàn)h-exo誘導的富糖肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位顯著促進了肝癌細胞在體內(nèi)的定植和肺轉(zhuǎn)移（圖3j，k），驗證了富糖肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位對轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的定植和存活以及隨后轉(zhuǎn)移灶生長的促進作用?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明外泌體不僅介導基質(zhì)剛度誘導的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成，而且在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中也是導致葡萄糖富集的主要因素。

由于其對基因表達的高調(diào)控作用，外泌體中的miRNA通常被認為是細胞間串擾的重要介質(zhì)。我們進一步確定了基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)外泌體中哪些miRNA在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中促進葡萄糖富集。我們進行小RNA測序以篩選MHCC97H-L-Exo和MHCC97H-H-Exo之間差異表達的miRNA。以|FC| > 1.5 （FC: fold change）和P < 0.05為閾值，我們共獲得了MHCC97-H-Exo中已知的15個差異表達miRNA，包括9個上調(diào)miRNA和6個下調(diào)miRNA（圖4a），我們采用miRNA qRT-PCR隨機驗證了一些差異miRNAs（let-7d-5p，miR-365a-5p，miR-194-5p，miR-125a-5p）的表達，這些miRNAs在MHCC97H-H-Exo中均表現(xiàn)出顯著上調(diào)（圖4b），表明測序結(jié)果的可靠性。而在Hep3B-H-Exo中，除miR-194-5p外，這些miRNA也表現(xiàn)出過表達（圖4b）。因此，我們分別將9個上調(diào)的miRNA模擬物轉(zhuǎn)染到肺成纖維細胞中，以確定不同miRNA對葡萄糖富集的貢獻。糖酵解相關基因分析表明，與其他miRNA模擬物相比，let-7d-5p模擬物對SLC2A1、PFKP、PKM和HK2的表達具有最顯著的抑制作用（圖4c），這表明H-Exo中的let-7d-5p可能是調(diào)節(jié)肺成纖維細胞糖代謝最關鍵的miRNA。另一方面，我們采用慢病毒介導的過表達或RNAi技術構建let-7d-5p過表達或敲低的肺成纖維細胞，然后將其培養(yǎng)在體外反映肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的肺剛度底物上，分析糖酵解相關蛋白的表達。結(jié)果表明，let-7d-5p過表達可顯著抑制GLUT1、PFKP和HK2的表達，而let-7d-5p敲低可明顯改善其表達（圖4d）。有趣的是，在let-7d-5p過表達的肺成纖維細胞中，我們觀察到PKM在mRNA水平上下降（圖4c），但在蛋白質(zhì)水平上變化不大（圖4d）。此外，我們還評估了let-7d-5p對葡萄糖攝取的影響，發(fā)現(xiàn)let-7d-5p過表達明顯降低了肺成纖維細胞的葡萄糖攝取，而let-7d-5p敲低則提高了肺成纖維細胞的葡萄糖攝?。▓D4e），驗證了let-7d-5p上調(diào)對肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中葡萄糖富集的積極貢獻。

為了證實外泌體let-7d-5p對體內(nèi)葡萄糖富集的貢獻，我們通過尾靜脈注射let-7d-5p- oe /Exo來建立具有肺轉(zhuǎn)移前壁龕的無腫瘤小鼠模型。與圖1a和圖3f所描述的方法類似，我們每隔一天通過尾靜脈向C57BL/6小鼠體內(nèi)注射let-7d-5p-OE/Exo或Mock/Exo，誘導肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成。在誘導外泌體的第26天，我們觀察到let-7d-5p- oe / exo誘導小鼠新鮮肺組織中CD11b+CD45+ bmdc的比例顯著增加（圖4f），這突出了外泌體let-7d-5p在促進肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成中的重要作用。此外，我們檢測了外泌體誘導的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動物模型肺成纖維細胞（CD45-CD31-CD140a+）的糖代謝，發(fā)現(xiàn)與Mock/Exo組相比，let-7d-5p-OE/Exo組肺成纖維細胞的2-NBDG吸收顯著減少（圖4）。此外，let-7d-5p- oe /Exo給藥明顯抑制了外泌體誘導的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動物模型肺組織中GLUT1、PFKP和HK2的表達（圖4h），證實了外泌體let-7d-5p在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中葡萄糖富集的突出作用。

我們繼續(xù)測量外泌體誘導的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動物模型新鮮肺組織中MDSCs和CD8+ T細胞的比例。體外高葡萄糖促進MDSCs分化的發(fā)現(xiàn)反映了MDSCs在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的積累部分歸因于葡萄糖富集（圖2i）。因此，葡萄糖富集可能參與強化肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的免疫抑制微環(huán)境。為了明確let-7d-5p-OE/ exo誘導的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動物模型對HCC轉(zhuǎn)移的影響，我們將HCC細胞靜脈注射到肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位動物模型中，并在第61天（HCC細胞注射后35天）檢測兩組肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況。結(jié)果顯示，let-7d-5p- oe /Exo組肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量和大小顯著增加（圖4i），驗證了外泌體let-7d-5p誘導的富含葡萄糖的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位作為有利的微環(huán)境有利于CTC的定植和轉(zhuǎn)移灶的發(fā)展。

為了闡明let-7d-5p調(diào)節(jié)肺成纖維細胞葡萄糖代謝的分子機制，我們使用TargetScan、miRWalk和miRTarBase三種公開的生物信息學工具篩選let-7d-5p的常見候選靶蛋白，獲得154種常見候選蛋白（圖5a）。在這些候選蛋白中，我們基于以下原因確定HMGA2為let-7d-5p的靶蛋白：（1）HMGA2在let-7d-5p靶蛋白的預測分析中得分最高。（2）TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示HMGA2與肺癌和肝癌組織中糖酵解途徑呈正相關。考慮到外泌體let-7d-5p進入受體細胞（肺成纖維細胞）相當于受體細胞中let-7d-5p的上調(diào)，我們隨后用慢病毒感染肺成纖維細胞，以確定let-7d-5p上調(diào)或下調(diào)對HMGA2表達的影響。結(jié)果表明，過表達let-7d-5p可顯著抑制HMGA2的蛋白表達，而敲低let-7d-5p可增加HMGA2的蛋白表達（圖5b），表明let-7d-5p與HMGA2之間存在負向調(diào)控作用。此外，利用TargetScan Human version 8.0的數(shù)據(jù)，我們觀察到在HMGA2 mRNA的3'UTR中存在7個假定的let-7d-5p結(jié)合區(qū)，并且所有結(jié)合區(qū)都包含共同序列（圖5c）。隨后，我們進行了熒光素酶報告基因測定，以明確let-7d-5p是否特異性結(jié)合HMGA2 mRNA的3'UTR。圖5c的結(jié)果顯示，與對照組相比，let-7d-5p和HMGA2 3’utr - wt共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性明顯降低，而HMGA2 3’utr -mut組的熒光素酶活性保持不變（圖5c），這表明let-7d-5p特異性結(jié)合HMGA2 mRNA的3’utr并調(diào)節(jié)其蛋白表達。這些數(shù)據(jù)證實HMGA2是let-7d-5p的靶蛋白。我們將HMGA2- oe質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到let-7d-5p過表達的肺成纖維細胞中，進一步驗證let-7d-5p是否通過HMGA2調(diào)節(jié)肺成纖維細胞的糖代謝。正如預期的那樣，HMGA2過表達明顯增加了對照細胞中GLUT1、PFKP和HK2的表達，也恢復了這些因let-7d-5p過表達而被耗盡的蛋白的水平（圖5d）。

HMGA2作為結(jié)構轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)包括E2F1在內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子的活性，HMGA2與Rb相互作用增強垂體腺瘤中E2F1的乙?；突钚?。因此，我們猜測外泌體let-7d-5p可能通過影響HDAC1與Rb-E2F1復合物的分離來調(diào)節(jié)肺成纖維細胞中E2F1的乙酰化。我們利用免疫沉淀法證實了HMGA2和Rb在肺成纖維細胞核蛋白中的相互作用（圖5e）。然后，我們從let-7d-5p過表達或下調(diào)的肺成纖維細胞中提取核蛋白，以Rb為誘餌蛋白捕獲HMGA2、HDAC1和E2F1。圖5f的結(jié)果顯示，在let-7d-5p過表達的肺成纖維細胞中，HDAC1與Rb的相互作用較多，而在let-7d-5p下調(diào)的細胞中，HDAC1與Rb的相互作用較少。同時，HMGA2能夠與HDAC1競爭結(jié)合Rb，但對E2F1與Rb的結(jié)合影響不大（圖5f）。除此之外，我們用Rb抗體免疫沉淀核蛋白后，進行了定量實驗（ELISA），專門檢測捕獲蛋白中HDAC1蛋白的水平。我們發(fā)現(xiàn)，在具有let-7d-5p-OE的肺成纖維細胞中，HDAC1與Rb相互作用的水平明顯增加，而在具有抗let-7d-5p的肺成纖維細胞中，HDAC1與Rb相互作用的水平顯著降低，這表明HMGA2上調(diào)增加了HDAC1與Rb- e2f1復合物的解離。為了進一步證明let-7d-5p是否可以通過HMGA2調(diào)節(jié)E2F1的乙?；?，我們采用免疫沉淀法捕獲let-7d-5p過表達或下調(diào)的肺成纖維細胞核蛋白中的E2F1，檢測E2F1的乙酰化水平。我們觀察到，在let-7d-5p過表達的肺成纖維細胞中，HDAC1與E2F1相互作用較多，E2F1乙?；捷^低（圖5g）。相反，在let-7d-5p下調(diào)的肺成纖維細胞中，與E2F1相互作用的HDAC1較少，E2F1乙酰化增加（圖5）。這些數(shù)據(jù)表明，let-7d-5p上調(diào)確實增加了HDAC1與E2F1的結(jié)合，從而減弱了E2F1乙酰化水平。轉(zhuǎn)錄因子通常通過結(jié)合靶基因的啟動子序列來調(diào)節(jié)靶基因的表達53。通過JASPAR數(shù)據(jù)庫分析，我們預測E2F1是一個潛在的轉(zhuǎn)錄因子，可以結(jié)合到三個糖酵解相關基因的啟動子區(qū)域，包括SLC2A1、PFKP和HK2。通過ChIP-qPCR，我們證實肺成纖維細胞中SLC2A1、PFKP和HK2啟動子上E2F1的占用增加（圖5h）。

為了進一步闡明E2F1乙?；谡{(diào)節(jié)GLUT1、PFKP和HK2表達中的作用，我們使用HDAC1抑制劑TSA治療let-7d-5p過表達的肺成纖維細胞。TSA干預明顯挽救了let-7d-5p過表達導致的E2F1乙?；档停▓D5i），并恢復了靶蛋白GLUT1、PFKP和HK2的表達（圖5i）。我們分別將Flag-E2F1（WT）- oe質(zhì)粒或Flag-E2F1（K117/120/125 R）- oe質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到let-7d-5p下調(diào)的肺成纖維細胞或?qū)φ占毎?，證實細胞中E2F1蛋白過表達（Supplementary Fig. 5g）。隨后的免疫沉淀分析顯示，無論在let-7d-5p下調(diào)組還是對照組，使用Flag-E2F1（K117/120/125 R）oe質(zhì)粒的肺成纖維細胞中，E2F1的乙?；骄@著低于使用Flag-E2F1（WT）- oe質(zhì)粒的肺成纖維細胞（圖5j）。更重要的是，K117/120/125 R突變明顯逆轉(zhuǎn)了let-7d-5p敲低引起的靶蛋白（GLUT1、PFKP和HK2）上調(diào)（圖5k）。因此，K117、K120和K125確實是E2F1的主要乙?；稽c，其乙?；接绊懓械鞍椎谋磉_。綜上所述，上述證據(jù)表明，肺成纖維細胞中基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)的外泌體let-7d-5p/HMGA2/E2F1乙酰化/GLUT1、PFKP和HK2通路參與了葡萄糖富集的調(diào)節(jié)。

除了肺成纖維細胞葡萄糖消耗減少對葡萄糖富集的貢獻外，血管生成和血管通透性作為轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的關鍵特征，也通過增加葡萄糖供應來影響葡萄糖富集。基于上述鑒定的差異miRNA，我們繼續(xù)確定基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)外泌體中哪些miRNA在肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成過程中有效控制血管生成和血管通透性。我們分別將9種上調(diào)的miRNA模擬物轉(zhuǎn)染到HUVECs中，分析了不同miRNA對血管生成和血管通透性的貢獻。只有miR-365a-5p明顯抑制HUVECs中TJP1（ZO-1的基因名稱）和CDH5（VE-cadherin的基因名稱）的表達（圖6a）。此外，miR-365a-5p mimic顯著降低了ZO-1和VE-cadherin的蛋白水平，但升高了VEGFR2的蛋白水平，而miR-365a-5p inhibitor則表現(xiàn)出相反的效果（圖6b）。我們進一步分析了miR-365a-5p是否會破壞內(nèi)皮屏障的完整性，促進癌細胞外滲（圖6c），發(fā)現(xiàn)異位表達miR-365a-5p的HUVEC單層對fitc -葡聚糖和MHCC97H-GFP細胞的滲透性更強（圖6d，e）。相反，在HUVEC中敲低miR-365-5p會導致內(nèi)皮滲漏明顯減少（圖6d，e）。為了闡明miR-365a-5p在血管生成中的作用，我們進行了體內(nèi)絨毛膜尿囊膜（CAM）測定和體外試管形成測定。miR-365-1-5p（小鼠miR-365-1-5p序列與人類miR-365a-5p相同）在Hepa1-6細胞中穩(wěn)定過表達，并收集其條件培養(yǎng)基進行CAM檢測。與Hepa1-6-Mock/CM處理的對照組相比，Hepa1-6-miR-365-1-5p-OE/CM處理的CAM血管數(shù)量顯著增加（圖6f）。在體外成管實驗中，HUVECs中miR-365a-5p的異位表達也增加了管的數(shù)量，而miR-365a-5p的敲低則減少了管的數(shù)量（圖6g）。這些結(jié)果驗證了來自HCC細胞的miR-365a-5p（miR-365-1-5p）足以誘導血管內(nèi)皮細胞并誘導血管通透性和血管生成。

隨后，進行體內(nèi)fitc -葡聚糖通透性測定，以評估外泌體miR-365a-5p對血管通透性的影響。每隔一天通過尾靜脈注射外泌體，持續(xù)26天。與PBS或Mock/Exo組相比，miR-365-1-5p- oe /Exo組中的FITC‐葡聚糖更容易從肺血管外滲（圖6h，i），這意味著外泌體miR-365-1-5p可以通過培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞來破壞肺血管完整性。同時，miR-365-1-5p- oe /Exo組肺組織中CD31表達增強（圖6j，k）。上述結(jié)果表明，外泌體miR-365a-5p（miR-365-1-5p）有助于肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的血管生成和血管通透性。

使用三種公開可用的生物信息學工具（TargetScan、miRWalk和miRTarBase），我們獲得了miR-365a-5p的97個常見靶蛋白（圖7a）。在這些候選靶蛋白中，我們選擇TRPC4AP作為miR-365a-5p的靶蛋白，是因為鈣內(nèi)流對血管功能的影響很大，而且在TCGA分析中，TRPC4AP與TJP1（ZO-1的基因名稱）或CDH5（VE-cadherin的基因名稱）呈正相關如圖7b所示，miR-365a-5p模擬物顯著下調(diào)TRPC4AP的表達，而miR-365a-5p抑制劑在HUVECs中顯著上調(diào)TRPC4AP的表達，表明miR-365a-5p與其靶蛋白TRPC4AP之間存在負調(diào)控作用。此外，熒光素酶報告基因檢測顯示，在TRPC4AP 3’utr - wt和miR-365a-5p mimic共轉(zhuǎn)染的細胞中，熒光素酶活性顯著降低，但在TRPC4AP 3’utr -mut和miR-365a-5p mimic共轉(zhuǎn)染的細胞中，熒光素酶活性保持不變（圖7c），進一步驗證了miR-365a-5p對TRPC4AP表達的特異性調(diào)節(jié)作用。TRPC4AP是一種鈣離子通道相關蛋白，可與TRPC4相互作用，增強儲存操作的Ca2+進入并增加細胞內(nèi)鈣。為了揭示miR-365a-5p是否調(diào)節(jié)trpc4ap誘導的Ca2+內(nèi)流，我們使用Ca2+敏感染料Fluo-4 AM檢測轉(zhuǎn)染miR-365a-5p模擬物或抑制劑的HUVECs中的Ca2+內(nèi)流。我們發(fā)現(xiàn)miR-365a-5p模擬物顯著降低了HUVECs細胞內(nèi)Ca2+的熒光強度，而miR-365a-5p抑制劑明顯提高了熒光強度（圖7d），這表明miR-365a-5p可以抑制TRPC4AP的表達，減少HUVECs中的鈣內(nèi)流。

隨著細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加，CaMKII（一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶）經(jīng)常被激活磷酸化下游分子，如MAPK、AMPK、AKT和SRC。在一份報告中，抑制CaMKII可以通過MEKK3/MEK5/ERK5信號通路逆轉(zhuǎn)piezo1誘導的原發(fā)性HUVECs中KLF2/4的表達。KLF2通常通過抑制VEGFR2的表達負向調(diào)節(jié)血管生成，而KLF4則通過激活ZO-1和VE-cadherin表達參與維持血管完整性。因此，我們推測miR-365a-5p通過抑制CaMKII/ERK5通路逆轉(zhuǎn)trpc4ap激活的KLF2/4表達。我們檢測了CaMKII/ERK5/KLF2/4在具有miR-365a-5p模擬物或抑制劑的HUVECs中的激活狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)miR-365a-5p模擬物顯著抑制CaMKII和ERK5的磷酸化水平以及KLF2和KLF4的表達水平（圖7e）。相反，miR-365a-5p抑制劑明顯逆轉(zhuǎn)了上述變化（圖7e），表明miR-365a-5p確實通過抑制TRPC4AP來破壞CaMKII/ERK5/KLF2/4的激活。接下來，我們將TRPC4AP- oe質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到具有miR-365a-5p模擬物的HUVECs中，并進一步確定miR-365a-5p是否通過滅活TRPC4AP/Ca2+/CaMKII/ERK5/KLF2/4途徑增加血管生成和血管通透性。如圖7f所示，miR-365a-5p mimic顯著增加了VEGFR2的表達，降低了ZO-1和VE-cadherin的表達，而TRPC4AP上調(diào)阻止了miR-365a-5p在CaMKII/ERK5/KLF2/4通路中的失活作用（圖7f）。值得注意的是，KLF4沉默減弱了miR-365a-5p抑制劑對ZO-1和VE-cadherin表達的促進作用（圖7g），KLF2沉默逆轉(zhuǎn)了miR-365a-5p抑制劑對VEGFR2表達的抑制作用（圖7h）?？偟膩碚f，外泌體miR-365a-5p抑制TRPC4AP表達，使CaMKII/ERK5/KLF2/4信號失活，從而促進血管生成和血管通透性。

基質(zhì)硬化主要是由于I型膠原（COL1）等細胞外基質(zhì)蛋白過度沉積和交聯(lián)所致。賴基氧氧化酶（LOX）能有效提高細胞外基質(zhì)蛋白的交聯(lián)水平。因此，COL1和LOX的表達水平常被用來指示肝基質(zhì)僵硬程度。以腫瘤組織中COL1和LOX的中位數(shù)表達為閾值，將HCC患者分為兩組：COL1low/LOXlow組（低剛度組，24例）和COL1high/LOX high組（高剛度組，24例）。我們通過FISH檢測肝癌組織中let-7d-5p和miR-365a-5p的表達，發(fā)現(xiàn)COL1high/LOX high組中let-7d-5p和miR-365a-5p的表達水平均明顯高于COL1low/LOX low組（圖8a，b），表明基質(zhì)硬度與let-7d-5p或miR-365a-5p表達呈正相關（圖8a，b）。接下來，我們分析COL1/LOX表達與臨床病理指標如腫瘤大小、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COL1high/LOX high組HCC組織中let-7d-5p和miR-365a-5p水平較高，腫瘤分化程度較差，COL1high/LOX high組HCC患者腫瘤復發(fā)率較高。生存分析顯示，COL1high/LOX high組HCC患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）較差（圖8c）。根據(jù)let-7d-5p和miR-365a-5p的中位表達水平，我們進一步將HCC患者分為let-7d-5p low/miR-365a-5p low組（16例）和let-7d-5p high/miR-365a-5p high組（16例）。我們發(fā)現(xiàn)let-7d-5p high/miR-365a-5p high組HCC患者在生存分析中有不利的OS和DFS（圖8d）。在TCGA肝癌患者隊列中，我們還發(fā)現(xiàn)let-7d- high/ miR-365a- high表明不利的OS和DFS。因此，這些數(shù)據(jù)表明，HCC組織中高基質(zhì)剛度與let-7d-5p或miR-365a-5p表達增加密切相關，與細胞實驗結(jié)果一致。高基質(zhì)剛度和高表達let-7d-5p/ miR-365a-5p能更好地預測HCC患者預后不良及腫瘤復發(fā)。

總之，本研究提出，葡萄糖富集是由基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)的外泌體miRNA引發(fā)的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的新特征，對于HCC細胞的定植和存活以及轉(zhuǎn)移灶的形成至關重要。據(jù)我們所知，這是第一篇探討基質(zhì)硬度對HCC中葡萄糖富集的肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成的影響及其相關機制的報道。本研究結(jié)果將豐富和更新腫瘤轉(zhuǎn)移前生態(tài)位理論，為今后腫瘤轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的干預提供新的方向。

小RNA測序、熒光素酶報告基因測定、ChIP-qPCR、TargetScan、miRWalk和miRTarBase分析、TCGA數(shù)據(jù)庫分析、代謝組學、慢病毒介導的過表達或RNAi技術、qRT-PCR、miRNA qRT-PCR、Western blot、雙熒光素酶報告試驗、ELISA、細胞培養(yǎng)、共培養(yǎng)、細胞死亡檢測、葡萄糖攝取和消耗試驗、細胞粘附試驗、跨內(nèi)皮浸潤試驗、細胞內(nèi)Ca2+測定、流式細胞術分析、雞胚絨毛膜尿囊膜、試管形成試驗、小鼠實驗、肺組織解離和單細胞懸液分離、外泌體分離、鑒定和跟蹤、葡萄糖、抑制劑、激動劑和功能阻斷抗體的干預、骨髓細胞（BMCs）的分離和分化、FITC-葡聚糖漏性試驗、蘇木精-伊紅（HE）和周期性酸-希夫（PAS）染色、免疫熒光共聚焦成像、病理切片、免疫組化分析

Zhao, Y., Yu, H., Li, J., Qian, J., Li, M., Zhang, X., Wang, M., Wang, Y., Dong, Y., You, Y., Zhou, Q., Gao, D., Zhao, Y., Liu, B., Chen, R., Ren, Z., Wang, Z., Zhang, K., & Cui, J. (2025). A glucose-enriched lung pre-metastatic niche triggered by matrix stiffness-tuned exosomal miRNAs in hepatocellular carcinoma. Nature communications, 16(1), 1736. https://doi.org/10.1038/s41467-025-56878-