當前結直腸癌（CRC）免疫治療效果受限于抗腫瘤免疫抑制，circRNA 與腫瘤免疫的關聯(lián)備受關注。研究人員經生物信息分析、qRT-PCR、原位雜交等實驗發(fā)現(xiàn)，CRC 患者中 circMVP 表達上調，且與預后不良相關。功能實驗證實，circMVP 可促進 CRC 細胞增殖、侵襲和體內腫瘤發(fā)生。機制上，circMVP 與 METTL3 相互作用，穩(wěn)定其在細胞核中的表達，增強 CTNNB1 的 m6A 修飾，提升 β - 連環(huán)蛋白表達，進而激活B7-H3 表達，抑制抗腫瘤免疫反應。重要的是，抑制 circMVP 表達能顯著改善抗 B7-H3 免疫治療效果。該研究表明 circMVP 或可作為 CRC 免疫逃逸的預測指標和潛在治療靶點，為 CRC 免疫治療開辟新思路。這篇文章于2025年1月發(fā)表于《International Journal of Biological Sciences》期刊上，IF:8.2。

在結直腸癌樣本中共鑒定出228個獨特的circRNA候選分子。其中，與作為對照的配對正常組織相比，有19個circRNA在結直腸癌組織中表達上調，18個表達下調（log2|倍數(shù)變化|≥1且P<0.05；圖1A）。散點圖展示了結直腸癌組織與配對的相鄰正常組織之間circRNA表達的差異（圖1A）。circMVP（hsa_circ_0000688，別名_000014）由MVP基因第8外顯子反向剪接形成，剪接后序列長度為256nt（圖1B），在結直腸癌組織中呈穩(wěn)定上調趨勢。桑格測序也驗證了其頭對尾融合位點的排列（圖1C）。Northern印跡分析表明circMVP在結直腸癌細胞中表達（圖1D）。

使用RKO（結直腸癌細胞）和293T細胞來研究circMVP的存在情況。通過設計特異性的發(fā)散引物和收斂引物進行PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示存在circMVP的反向剪接形式或經典形式，而非線性MVP（圖1E）。circMVP的環(huán)狀結構通過對RNase R消化的抗性得到證實（圖1F）。因此，對結直腸癌細胞系DLD1、HCT8、HCT116和RKO中的circMVP表達進行了評估。在這些細胞系中，DLD1和RKO細胞分別表現(xiàn)出最高和最低水平的circMVP表達（圖1G）。此外，MVP的表達與circMVP的趨勢一致，且這些表達特征與circRNA的生成生物學過程相符（圖1G、圖1I）。

RNA熒光原位雜交（FISH）檢測顯示，circMVP主要定位于細胞核中，但在細胞質中也有發(fā)現(xiàn)（圖1H）。細胞核和細胞質分離實驗證實，circMVP主要在細胞核中表達，部分在細胞質中表達（圖1I）。在結直腸癌樣本中，通過對切除組織切片進行原位雜交（ISH）分析來評估circMVP的表達。結果顯示，與正常上皮組織相比，結直腸癌組織中circMVP的表達升高（圖1J）。通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）評估了結直腸癌免疫微環(huán)境的細胞組成。通過PCA對所有細胞進行客觀聚類來闡明細胞組成，并使用UMAP進行可視化展示，包括檢測CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、巨噬細胞、內皮細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞、單核細胞、上皮細胞、樹突狀細胞、自然殺傷（NK）細胞、B細胞和成纖維細胞的細胞類型（圖1K）。MVP和circMVP主要在上皮細胞（結直腸癌細胞）簇中表達（圖1L）。因此，作者研究了circMVP在結直腸癌細胞中的具體表達情況。

測量了結直腸癌細胞系中circMVP的內源性表達，選擇了circMVP表達相對較高的DLD1細胞和表達相對較低的HCT8細胞，并根據(jù)轉染效率進行后續(xù)的功能實驗。CCK-8和集落形成實驗表明，敲低circMVP顯著抑制了結直腸癌細胞的增殖和集落形成，而circMVP過表達則促進了這些過程（圖2A）。通過Transwell實驗進一步研究了circMVP對結直腸癌轉移的影響，結果顯示敲低circMVP抑制了DLD1和HCT8細胞的遷移和侵襲。相反，circMVP過表達則顯著促進了這些過程（圖2C和2D）。此外，circMVP沉默抑制了小鼠體內結直腸癌的致瘤性，而circMVP過表達則促進了其致瘤性（圖2E和2F）。

通過對人類基因組和小鼠基因組的比較，發(fā)現(xiàn)circMVP在多種小鼠來源的細胞中表達，包括結直腸癌細胞，這進一步證明了circMVP在物種間表達的保守性和穩(wěn)定性（圖2G）。通過在C57BL/6小鼠皮下接種MC38細胞建立MC38腫瘤模型。circMVP促進了MC38細胞在體外的增殖、集落形成、遷移和侵襲。相反，敲低circMVP則阻礙了上述過程（圖2F - 2H）。確實，抑制circMVP可抑制結直腸癌的致瘤潛能，而其過表達則在C57BL/6小鼠中促進了致瘤性（圖2H和圖2I）。此外，分析結直腸癌組織樣本的空間轉錄組數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，上皮細胞群落中MVP的轉錄水平顯著更高（圖2J、圖2K）。綜上所述，這些結果表明circMVP具有促進結直腸癌進展的功能。

在體外對circMVP轉錄本進行生物素標記，以探索其下游分子。根據(jù)之前的結果，circMVP主要在結直腸癌細胞的細胞核中表達。因此，使用核蛋白標記鏈霉親和素磁珠進行RNA下拉檢測（圖3A）。通過考馬斯亮藍染色鑒定與circMVP結合的蛋白質。對特異性條帶進行蛋白質質譜分析和western blot分析，結果顯示circMVP直接與METTL3蛋白結合（圖3B、3C）。通過RNA免疫沉淀（RIP）檢測進一步證實了circMVP與METTL3的結合，該檢測顯示了METTL3與circMVP的RIP結果（圖3D）。RNA電泳遷移率變動分析（EMSA）證實了circMVP的核酸與METTL3特異性結合。在DLD1細胞中進行的IF和FISH檢測表明，circMVP和METTL3主要在細胞核中共定位（圖3E）。此外，作者觀察到抑制蛋白酶體活性可防止si-circMVP誘導的DLD1細胞內源性METTL3下調，這表明circMVP抑制了METTL3通過泛素化途徑的降解（圖3F）。

使用蛋白質合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）來評估circMVP對METTL3降解過程的影響。在DLD1細胞中敲低circMVP延長了METTL3的降解時間（圖3G）。METTL3作為MTase復合物中的關鍵催化劑，參與m6A修飾的添加過程。因此，評估了METTL3對circMVP表達的影響。RNA穩(wěn)定性實驗表明，circMVP與METTL3結合后穩(wěn)定性增加。分別轉染METTL3質粒和siMETTL3以實現(xiàn)circMVP的過表達和敲低，這表明了circMVP對METTL3的調節(jié)作用（圖3H）。這些結果表明，circMVP與METTL3結合并穩(wěn)定其表達，從而發(fā)揮促進結直腸癌進展的下游作用。

METTL3作為MTase復合物中的催化核心，負責m6A修飾的整合過程。對circMVP介導的METTL3調節(jié)的生物學功能評估顯示，通過斑點印跡檢測發(fā)現(xiàn)circMVP上調了RNA的m6A表達（圖4A）。當敲低circMVP或METTL3時，METTL3和m6A的表達下降（圖4B）。相反，上調circMVP或METTL3后，METTL3和m6A的表達增加（圖4B）。接下來，對在HCT8細胞中穩(wěn)定過表達circMVP的構建體進行轉錄組測序。GO分析表明，circMVP激活了包括免疫效應過程、細胞間粘附和上皮細胞增殖等生物學過程（圖4C）。KEGG分析表明，circMVP促進了Wnt信號通路的激活、癌癥中的轉錄失調、粘著斑以及細胞粘附分子等途徑（圖4D）。GSEA分析表明，circMVP促進了Wnt/β - 連環(huán)蛋白信號通路的激活。此外，評估了由Wnt/β - 連環(huán)蛋白信號通路激活所調節(jié)的基因轉錄水平。circMVP過表達后，由β - 連環(huán)蛋白調節(jié)的下游基因簇顯著上調（圖4E）。對細胞中circMVP、METTL3和β - 連環(huán)蛋白的表達和定位進行IF分析，結果表明circMVP過表達穩(wěn)定了METTL3，并上調了β - 連環(huán)蛋白的表達和核異位。此外，這表明circMVP/METTL3可能通過β - 連環(huán)蛋白信號通路調節(jié)下游信號通路和轉錄激活（圖4F）。

m6A修飾參與mRNA代謝的多種分子過程，包括可變剪接、精確翻譯和mRNA穩(wěn)定性的精細調節(jié)。本研究旨在通過使用基于序列的RNA腺苷甲基化預測器，分析CTNNB1的RNA序列中m6A修飾位點的分布情況，以探究METTL3介導的m6A修飾的影響。人類和小鼠的CTNNB1 mRNA均具有較高的m6A修飾置信區(qū)間。作者進行了m6A甲基化免疫沉淀RNA測序（MeRIP - seq），IGV分析顯示METTL3基因敲除（KO）后CTNNB1轉錄本上的m6A峰減少。此外，基序富集分析揭示了上述m6A峰中存在一個共同的序列基序“GGACU”（圖4G）；因此，研究了METTL3的m6A修飾對CTNNB1轉錄本的影響。在分子水平上，m6A修飾在多種mRNA代謝的調節(jié)中發(fā)揮作用。為了闡明METTL3介導的m6A修飾對CTNNB1 mRNA代謝的影響，使用PCR - 瓊脂糖凝膠電泳對CTNNB1轉錄本進行定性評估，并使用qRT - PCR對METTL3與CTNNB1 mRNA的結合進行定量分析（圖4H）。此外，在小鼠腫瘤細胞系中穩(wěn)定表達Ctnnb1（小鼠β - 連環(huán)蛋白的基因符號），并隨后將MC38細胞用作本研究的體內模型。這些結果表明，circMVP/METTL3催化β - 連環(huán)蛋白信號通路，并調節(jié)其下游基因的轉錄激活。

YTHDF1是一種關鍵的m6A讀取蛋白，它通過與起始因子和核糖體相互作用，促進m6A的沉積和mRNA的翻譯效率。研究了YTHDF1在METTL3對CTNNB1 mRNA的m6A “讀取” 效應中的作用。RIP - qPCR和鏈霉親和素RNA下拉實驗表明，YTHDF1在內源和外源均介導了β - 連環(huán)蛋白的增加，且DLD1細胞中CTNNB1的轉錄沒有顯著變化（圖4I）。qRT - PCR結果表明circMVP/METTL3不影響CTNNB1的轉錄。隨后，使用核糖體分析技術從對照組（NC）和circMVP組中分離出各種RNA組分。結果顯示，NC細胞中翻譯活躍的多聚核糖體（>80S）中CTNNB1 mRNA的表達顯著低于circMVP細胞，而在單體核糖體（<40S、40S、60S和80S）中的表達沒有顯著差異（圖4J）。值得注意的是，在DLD1細胞中過表達METTL3以及在HCT8細胞中下調METTL3后，觀察到m6A和β - 連環(huán)蛋白蛋白表達的恢復（圖4K）。

通過慢病毒將circMVP轉染到MC38小鼠結直腸癌細胞中，然后將這些細胞注射到同基因的C57BL6小鼠體內，以研究circMVP在調節(jié)抗腫瘤免疫中的作用。與NC組相比，circMVP組中通過ISH和IHC技術檢測到circMVP、METTL3、YTHDF1和β - 連環(huán)蛋白的表達增強（圖5A）。此外，觀察到β - 連環(huán)蛋白核定位的細胞百分比增加（圖5A）。通過分離和收集腫瘤的單細胞懸液并進行scRNA - seq，探索了circMVP對結直腸癌和腫瘤微環(huán)境（TME）的影響（NC組：18294個細胞；circMVP組：15040個細胞）。與NC組相比，circMVP組腫瘤中的T細胞和NK細胞顯著增加（圖5B）。對上皮細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、巨噬細胞、調節(jié)性T細胞（Treg）、內皮細胞、中性粒細胞和NK細胞亞群進行了進一步聚類分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，circMVP過表達組中這些細胞均增加（圖5B）。作者假設circMVP通過誘導細胞中的負性刺激分子來抑制抗腫瘤免疫。檢查了上皮細胞的功能標記物Grb2和Krt14，這些基因主要在上皮細胞簇中富集。通過分析結直腸組織中的TME細胞，研究了circMVP對結直腸癌發(fā)生過程中TME的影響。聚類分析顯示，與NC組相比，circMVP組中CD45+免疫細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、NK細胞和樹突狀細胞（DCs）顯著擴增，而成纖維細胞收縮（圖5C和圖5D）。CD8+ T細胞是主要的抗腫瘤免疫效應細胞，在腫瘤中具有重要作用，并以復雜的方式參與抗腫瘤免疫領域。本研究探索了circMVP對免疫細胞群體的影響，亞群分析顯示，與NC組相比，circMVP組中活化的CD8+ T細胞比例下降，而初始CD8+ T細胞比例增加（圖5E）。作者還評估了circMVP對NK細胞的影響。根據(jù)基因標記物鑒定出成熟、未成熟和其他NK細胞亞型。在circMVP組中觀察到未成熟NK細胞比例增加，成熟NK細胞比例下降。在circMVP組中也發(fā)現(xiàn)了其他類型的NK細胞，但數(shù)量太少無法準確鑒定（圖5F）。通過鑒定兩個亞群（CD86+巨噬細胞和其他未鑒定的巨噬細胞）來評估circMVP對巨噬細胞的影響（圖5G）。此外，在circMVP的作用下，Treg細胞簇進一步分為自然Treg細胞；然而，由于數(shù)量減少，無法將其他群落確定為明確的Tregs亞群（圖5H）。

上述結果表明，circMVP可能通過影響T細胞干擾結直腸癌的適應性免疫。分析腫瘤（上皮）細胞中免疫檢查點標記物的表達，circMVP組中共刺激分子轉錄水平的改變支持了這一假設。通過對免疫細胞進行流式細胞術分析，證實了circMVP對腫瘤中CD8+ T細胞比例的影響。circMVP過表達組中的CD8+ T細胞顯著低于NC組（圖5I）。對NC和circMVP標記的CD8+ T細胞進行分析，circMVP組和NC組CD8+ T細胞中的差異表達基因表明，circMVP抑制了CD8+ T免疫反應的激活（圖5J）。因此，體內數(shù)據(jù)的結果支持了circMVP在結直腸癌中的免疫抑制功能。

circMVP 通過增強 METTL3 來調節(jié) β- 連環(huán)蛋白的抗腫瘤免疫功能。circMVP的具體調節(jié)機制有待進一步評估。先前的研究表明，腫瘤細胞中的 β- 連環(huán)蛋白作為共轉錄因子參與基因調控，包括調節(jié)免疫檢查點基因的表達。轉錄組分析顯示，CD276（編碼 B7-H3）的轉錄顯著上調（圖 6A）。核質分離結果顯示，在 DLD1 細胞中敲低 circMVP 后，METTL3、β- 連環(huán)蛋白和 B7H3 蛋白的表達均下降。circMVP過表達后，METTL3 表達增加，β- 連環(huán)蛋白的核信號增強，B7-H3 表達上調（圖 6B）。在敲低 circMVP 的 DLD1 細胞中，過表達 METTL3 顯著逆轉了 β- 連環(huán)蛋白和 B7-H3 蛋白的表達變化；而在 HCT8 細胞中，過表達 circMVP 并下調 METTL3 后，B7-H3 的表達也發(fā)生了逆轉（圖 6C）。

接下來，研究 circMVP通過 METTL3/β- 連環(huán)蛋白對 B7-H3 的調節(jié)作用。ChIP-seq 數(shù)據(jù)分析顯示，β- 連環(huán)蛋白作用于 CD276 的染色質區(qū)域，并對 IGV 和 MEME 進行基序分析（圖 6D）。ChIP PCR - 瓊脂糖凝膠電泳和 ChIP qPCR 分析均表明，β- 連環(huán)蛋白作用于 CD276 的啟動子區(qū)域，進而調節(jié) CD276 轉錄的增加（圖 6E 和 6F）。IF 檢測顯示，敲低circMVP 的 DLD1 細胞中，METTL3 和 β- 連環(huán)蛋白的核異位現(xiàn)象減少（圖 6G）。敲低 circMVP 可能抑制 β- 連環(huán)蛋白作為轉錄因子的功能，qPCR 結果顯示 circMVP 和 METTL3 上調了 CD276 的表達（圖 6H）。在蛋白質表達水平上，在穩(wěn)定過表達 circMVP 的 DLD1 細胞中過表達 METTL3，在穩(wěn)定過表達 circMVP 的 HCT8 細胞中敲低 METTL3，然后進行核質分離檢測，結果表明 circMVP 促進了 β- 連環(huán)蛋白的核定位以及 B7-H3 蛋白的增加。敲除 METTL3 則抑制了這一現(xiàn)象（圖 6I）。裸鼠腫瘤的 IHC 檢測顯示，敲低 circMVP 降低了 B7-H3 蛋白的表達，B7-H3 主要在結直腸癌細胞的細胞質和細胞膜中表達，而 circMVP 的表達上調（圖 6J）。為探究 METTL3 是否直接作用于 CD276 mRNA 從而影響 B7-H3 蛋白的表達，作者分析了 METTL3 甲基化的 RIPseq 數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn) CD276 中不存在 METTL3 作用的顯著峰值。上述結果表明，circMVP 可能通過促進 β- 連環(huán)蛋白結合 METTL3 參與轉錄調控，進而調節(jié) B7-H3 的表達。

circMVP 促進腫瘤生成，并對 T 細胞效應具有抑制作用（圖5J）。重要的是，這可能暗示結直腸癌對免疫檢查點阻斷（ICB）治療的敏感性受到影響。因此，作者提出假設，針對 circMVP 生成或功能的干預措施可能會增強 ICB 的治療效果，特別是對于circMVP 陽性且對 ICB 耐藥的腫瘤。為驗證這一假設，作者用抗 B7-H3 抗體 Omburtamab，或 circMVP 陰性對照（NC）與敲低（shRNA）的組合，處理對 ICB 耐藥的 MC38 腫瘤（圖 7A）。與作者之前的發(fā)現(xiàn)一致，敲低 circMVP 抑制了腫瘤生長（圖 7B 和 7C）。此外，抗 B7-H3 組的腫瘤生長明顯低于抗 Ig 組。值得注意的是，抗B7-H3 與 circMVP 敲低聯(lián)合處理的小鼠表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制作用（圖 7B 和 7C）。盡管單一療法的療效在一定程度上令人滿意，但 circMVP 沉默與 ICB 聯(lián)合使用可顯著降低腫瘤負擔，而 circMVP + 抗 B7-H3 的聯(lián)合使用顯著提高了總體生存率（圖 7D）。對腫瘤中 circMVP敲低的 ISH 和 IHC 檢測還發(fā)現(xiàn)，它降低了 β- 連環(huán)蛋白的表達和核異位，同時下調了 B7-H3 的表達（圖 7E）。這些發(fā)現(xiàn)提供了關鍵證據(jù)，表明 circMVP 可能抑制 T 細胞的抗腫瘤作用以及B7-H3 的 ICB 協(xié)同效應。

通過 ISH 評估 circMVP 的表達，并用 IHC 檢測結直腸癌組織中 β- 連環(huán)蛋白和 B7-H3 的蛋白表達，以此探究 circMVP 與其下游靶點之間的相關性（圖 8A）。研究結果顯示，在 circMVP 高表達組中，58.02%（94/162）的結直腸癌組織樣本表現(xiàn)出 β- 連環(huán)蛋白和 B7-H3 表達水平的升高。這一比例明顯高于 circMVP 低表達組（圖 8B）。單因素和多因素 Cox 比例風險回歸分析確定 circMVP、METTL3 和 B7-H3 為結直腸癌的重要預后因素（圖 8C 和 8D）。生存分析表明，circMVP 表達與不良生存相關（P=0.0009，圖 8E），在 TCGA 結直腸癌患者中，METTL3 高表達（P=0.0054）和 B7-H3 高表達（P=0.0184）也預示著不良預后。此外，結直腸癌樣本中 METTL3 和 B7-H3 蛋白的表達均與 circMVP 表達呈正相關（圖 8F）。

使用 TCGA（COAD 和 READ）外部結直腸癌隊列來驗證B7-H3 作為結直腸癌潛在診斷和治療靶點的作用。TCGA-COAD 分析顯示，50.00%（135/270）的結直腸癌患者 B7-H3（CD276）高表達，且預后不良（P=0.046，圖 8G）。TCGA-READ 分析顯示，11.96%（11/92）的結直腸癌患者 B7-H3（CD276）高表達，且預后不良（P=0.020，圖 8G）?？傮w而言，作者的結果證明，METTL3 通過 circMVP 介導的 CTNNB1 mRNA 的 m6A 修飾促進激活，CTNNB1 翻譯的蛋白 β- 連環(huán)蛋白在結直腸癌中上調，這抑制了腫瘤微環(huán)境中依賴 B7-H3 的免疫抑制。

這項研究證明了circMVP 在結直腸癌中的一種新的調控功能，該功能促進癌細胞生長和免疫抑制。circMVP 與 METTL3 結合，調節(jié) CTNNB1 mRNA 的 m6A 甲基化，上調β-連環(huán)蛋白蛋白，并激活 B7-H3 表達。抑制 circMVP 表達干擾了 CRC 中 B7-H3 依賴的抗癌免疫。鑒定 circMVP/METTL3/β-連環(huán)素/B7-H3 信號軸為免疫抑制和腫瘤進展的分子機制提供了新的見解，為 CRC 確定了新的免疫治療靶點。

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Wang F, Wang Q, Wu Y, Huang Z, Zhong X, Wang H, Yang C, Qin Y, Qi X, Ge X, Mao Y. CircMVP promotes METTL3 activation mediated CTNNB1 m6A modification in the inhibition of colorectal cancer in B7-H3 dependence antitumor immunity. Int J Biol Sci. 2025 Jan 1;21(1):306-327. doi: 10.7150/ijbs.105324. PMID: 39744434; PMCID: PMC11667818.