來(lái)自人類(lèi)尿液干細(xì)胞的外泌體的DMBT1通過(guò)促進(jìn)血管的生成加速糖尿病創(chuàng)傷修復(fù)

慢性非治愈性傷口是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，需要先進(jìn)的治療策略。外泌體是細(xì)胞旁分泌作用的關(guān)鍵介質(zhì)，可以直接作為組織修復(fù)和再生的治療劑。在2018年2月7日發(fā)表于期刊《Theranostics》(IF=8.766)的《Exosomal DMBT1 from human urine-derived stem cells facilitates diabetic wound repair by promoting Angiogenesis》中，作者探討了人類(lèi)尿源性干細(xì)胞（USC-Exos）對(duì)糖尿病傷口愈合的作用和機(jī)制。

用流式細(xì)胞儀和多向分化潛能分析描述USCs的特點(diǎn)。USCs-Exos從USCs的條件培養(yǎng)基中分離，并通過(guò)透射電鏡和流式細(xì)胞儀鑒定。然后作者進(jìn)行了一系列功能分析去評(píng)估USC-Exos對(duì)創(chuàng)面愈合相關(guān)細(xì)胞活性的影響。另外，作者通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析檢測(cè)了USC- Exos和USCs的蛋白圖譜差異，篩選出USC- Exos和USCs顯著差異蛋白。USC- Exos在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠傷口愈合的影響通過(guò)測(cè)量傷口閉合率、組織學(xué)和免疫熒光分析進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，評(píng)估了候選蛋白在USC-Exos誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管生成活性調(diào)節(jié)和糖尿病傷口愈合中的作用。

研究發(fā)現(xiàn)USCs 呈CD29、CD44，CD73和CD90陽(yáng)性，同時(shí)呈現(xiàn)CD34和CD45陰性。USCs能夠分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。USC- Exos呈現(xiàn)出杯形或平均直徑為51.57±2.93 nm的球形外觀(guān)，且CD63和TSG101呈陽(yáng)性。USC- Exos可以增強(qiáng)傷口愈合相關(guān)細(xì)胞的功能特性包括內(nèi)皮細(xì)胞生成血管的活性。USC -Exos富含參與傷口愈合相關(guān)生物學(xué)過(guò)程的蛋白質(zhì)。特別是促血管生成蛋白DMBT1在USC -Exos中高度表達(dá)。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，DMBT1蛋白是USC-Exos誘導(dǎo)的促內(nèi)皮細(xì)胞血管生成應(yīng)答以及糖尿病小鼠中的血管生成和傷口愈合所需的。作者的研究成果表明，USC-Exos可能通過(guò)轉(zhuǎn)移DMBT1蛋白促進(jìn)血管生成，這可能成為糖尿病組織創(chuàng)傷愈合的有前途的治療策略。

技術(shù)路線(xiàn)：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.USC和USC-Exos分離與鑒定

圖1. USC和USC-Exos的鑒定。（A）USCs顯示出紡錘狀的形態(tài)。通過(guò)茜素紅S染色（B-a），油紅O染色（B-b）和阿爾新藍(lán)染色（B-c）證明，USCs能夠分化成成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。（C）流式細(xì)胞術(shù)分析USCs上的細(xì)胞表面標(biāo)記。（D）透射電子顯微鏡下USC-Exos的形態(tài)學(xué)。（E）外泌體直徑分布。（F）流式細(xì)胞儀鑒定USC-Exos。

2.USC-Exos促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖遷移

圖2. USC-Exos增強(qiáng)角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖遷移。（A）PKH67標(biāo)記的熒光顯微鏡分析人類(lèi)角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和皮膚成纖維細(xì)胞 （HSFs）的USC-Exos內(nèi)化作用。（B）通過(guò)CCK-8分析檢測(cè)接受不同處理下的HaCaT和HSF的細(xì)胞增殖情況。（C）（D）用USC-Exos或PBS處理的HaCaT中劃痕實(shí)驗(yàn)；（E）（F）通過(guò)transwell測(cè)定檢測(cè)由USC-Exos或等體積的PBS孵育的HSF的遷移。

3.USC-Exos增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞生成血管的活性

圖3. USC-Exos增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞生成血管的活性。（A）熒光顯微鏡分析顯示USC-Exos被人類(lèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMECs）攝取。（B）（C）小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)USC-Exos或PBS處理的HMEC。（D）CCK-8分析結(jié)果顯示，USC-Exos孵育HMEC后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。（E-H）Transwell分析和劃痕傷口愈合測(cè)定顯示USC-Exos孵育增強(qiáng)了HMEC的遷移和侵襲能力。

4.USC和USC-Exos的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

圖4. USC和USC-Exos孵育組的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。(A)GO功能富集顯示差異表達(dá)蛋白參與一系列傷口愈合相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。 (B）與USC孵育組相比，USC-Exos組中血管生成相關(guān)蛋白和外泌體標(biāo)志物的表達(dá)情況。（C）Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證USC-Exos和USCs中的DMBT1，VEGF-A和一系列外泌體標(biāo)記蛋白的表達(dá)情況。

5.DMBT1介導(dǎo)USC-Exos在內(nèi)皮細(xì)胞上促血管生成的作用

圖5. DMBT1介導(dǎo)的USC-Exos在內(nèi)皮細(xì)胞上促血管生成作用。（A）通過(guò)qRT-PCR分析進(jìn)行靶向DMBT1的shRNA抑制效率的驗(yàn)證。（B）用Western印跡法驗(yàn)證USCsshDMBT1 #1-Exos和USCsCon shRNA-Exos。（C）通過(guò)CCK-8分析測(cè)試經(jīng)過(guò)不同處理的HMEC的增殖。（D-G）通過(guò)劃傷試驗(yàn)檢測(cè)HMEC的遷移。（H）HMEC中的管形成測(cè)定的代表性圖像。（I-K）定量分析總管（H）中的長(zhǎng)度，總分支點(diǎn)和總循環(huán)。（L）通過(guò)western印跡處理檢測(cè)HMECs中VEGF-A，Akt和p-Akt蛋白水平的變化。

6.外泌體的DMBT1加速糖尿病小鼠皮膚傷口的愈合

圖6.外泌體DMBT1加速糖尿病小鼠的皮膚傷口愈合。（A）用PBS處理的傷口的總視圖。（B）接受不同治療的傷口閉合率。（C）傷口切片的H＆E染色。（D）（C）中瘢痕寬度的定量分析和上皮再生的程度。（E）傷口切片的Masson三色染色。（F）（E）中Masson染色區(qū)域的平均強(qiáng)度的定量分析。（G）傷口切片染色的ki67的代表性圖像。（H）在（F）中ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的定量研究。

7.外泌體的DMBT1促進(jìn)糖尿病小鼠傷口部位的血管生成

圖7。外泌體DMBT1促進(jìn)糖尿病小鼠創(chuàng)面血管生成。（A）用PBS，USCsCon處理的傷口的總視圖。在傷口處發(fā)現(xiàn)新形成的血管。（B）傷口切片的CD31免疫熒光染色。（C）（B）中血管密度的定量分析。