單細(xì)胞外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌干細(xì)胞三個(gè)驅(qū)動(dòng)突變基因KCP, LOC440040 和LOC440563

    腎細(xì)胞癌（RCC）占成人惡性腫瘤3%。腫瘤干細(xì)胞在腎癌發(fā)生、發(fā)展和耐藥性產(chǎn)生中起重要作用。最近，單細(xì)胞外顯子組測(cè)序已被用于評(píng)估多類腫瘤的體細(xì)胞突變，尚未系統(tǒng)地運(yùn)用于識(shí)別腫瘤干細(xì)胞的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因。作者從RCC病人體內(nèi)分離CD133+RCC 和CD133–RCC 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有CD133+RCC 細(xì)胞具有 sphere-forming capability。將CD31–CD45– ，CD31–CD45–CD133–，和CD31–CD45–CD133+RCC分別皮下注射到NOD/SCID小鼠，結(jié)果顯示注射CD31–CD45–CD133+ 細(xì)胞的小鼠可見(jiàn)明顯腫瘤，注射其它兩類細(xì)胞小鼠體內(nèi)都未發(fā)現(xiàn)腫瘤。

    作者又從同一個(gè)病人體內(nèi)分離10個(gè)CD133+RCC， CD133–RCC和正常腎細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞外顯子組測(cè)序，癌組織和癌旁組織進(jìn)行外顯子組測(cè)序。發(fā)現(xiàn)大部分突變集中在CD133+RCC中（圖1A），KCP基因的c.A241T>p.R81W突變，LOC440563基因的c.G316A>p.G106S突變，和LOC440040基因的c.A406T>p.N136Y 突變。C/G>T/A，A/T>C/G 和A/T>G/C 突變?cè)赗CC中常見(jiàn)，相較于CD133–RCC，A/T>T/A突變?cè)贑D133+RCC中更為常見(jiàn)（圖1B）。 通過(guò)PCA分析，發(fā)現(xiàn)CD133+RCC散亂分布且離正常腎細(xì)胞與CD133–RCC較遠(yuǎn)（圖1D）。進(jìn)化樹(shù)分析顯示正常腎細(xì)胞與CD133–RCC距離更近 （圖1E）。利用CRISPR-Cas9技術(shù)導(dǎo)入20個(gè)突變基因到786-O，發(fā)現(xiàn) KCP突變促進(jìn)細(xì)胞成球，將余下基因與 KCP 搭配導(dǎo)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LOC440040 與 KCP 協(xié)同突變顯著增強(qiáng)細(xì)胞成球力。KCP 、LOC440040 、LOC440563 三者協(xié)同突變，效果最佳，將三者突變的細(xì)胞導(dǎo)入小鼠，檢測(cè)到更多腫瘤。對(duì) 57個(gè)病人的KCP 、LOC440040 、LOC440563 突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序，結(jié)果顯示超過(guò)20% 病人至少攜帶一個(gè)突變（圖1H），5.2% 同時(shí)攜帶這三個(gè)突變（圖1K）。這些病人切除原發(fā)瘤后，腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間明顯短于其他人（圖1L）。

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