頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）是一種非常侵襲性疾病，其特征是腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）異質(zhì)性。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是TIME中的主要天然免疫細(xì)胞群，它們參與惡性腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)過(guò)程。SPP1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞（SPP1 + Macs）在許多癌癥中都有發(fā)現(xiàn)，但它們對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的影響尚不清楚。本研究旨在識(shí)別并驗(yàn)證SPP1 + Macs在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌惡性進(jìn)展中的作用和功能。單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）結(jié)果顯示，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤免疫微環(huán)境中，髓系細(xì)胞具有異質(zhì)性，并且與腫瘤細(xì)胞強(qiáng)烈相關(guān)，并識(shí)別出了與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良正相關(guān)的腫瘤特異性SPP1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞。GSVA表明，SPP1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞積極參與細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Luminex液態(tài)懸浮芯片檢測(cè)分析表明，SPP1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞來(lái)源的TNF-α和IL-1β起著重要作用。無(wú)論是在體外實(shí)驗(yàn)還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，以及使用VGX-1027（一種抑制巨噬細(xì)胞來(lái)源的TNF-α和IL-1β的抑制劑）都證實(shí)了SPP1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞來(lái)源的TNF-α和IL-1β通過(guò)支持腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移來(lái)促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。從機(jī)制上講，，。此外，SPP1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞來(lái)源的TNF-α和IL-1β通過(guò)不同的信號(hào)通路促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞和其他鄰近巨噬細(xì)胞中OPN的表達(dá)。SPP1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞可能是一個(gè)候選靶點(diǎn)，通過(guò)它能夠增強(qiáng)抗腫瘤效果。本文于2024年12月發(fā)表于“J Exp Clin Cancer Res”（IF=11.4）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）在HNSCC臨床樣本中鑒定出腫瘤特異性SPP1⁺ Macs

為了確定頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）的細(xì)胞組成，我們收集了5對(duì)相鄰的正常組織和腫瘤組織，并將其消化成單細(xì)胞懸液進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序分析（圖1A）。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制和不純細(xì)胞過(guò)濾后，保留了71,539個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行后續(xù)分析。通過(guò)UMAP進(jìn)行降維處理后，將這些細(xì)胞分為14個(gè)簇，然后歸類為九種主要細(xì)胞類型（圖1B，C），如下：上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，肥大細(xì)胞，髓系細(xì)胞，漿細(xì)胞和T細(xì)胞。所有五種患者的相鄰正常組織和腫瘤組織中都存在這九種主要細(xì)胞類型。然而，每種細(xì)胞類型的浸潤(rùn)程度不同，這可能反映了頭頸部鱗狀細(xì)胞癌階段的差異（圖1D）。為了進(jìn)一步探索頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤免疫微環(huán)境（TIME），我們比較了相鄰正常組織和腫瘤組織之間免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞的比例，并將免疫細(xì)胞分為五個(gè)亞群：B細(xì)胞（MS4A1和BANK1），肥大細(xì)胞（TPSAB1和CPA3），漿細(xì)胞（JCHAIN和TNFRSF17），髓系細(xì)胞（FPR3和MS4A4A）和T細(xì)胞（CD3D和CD3E）（圖1E，F）。與每位患者的相鄰正常組織相比，腫瘤組織中的髓系細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞的數(shù)量有所上調(diào)。在所有相鄰正常組織中，髓系細(xì)胞大約占免疫細(xì)胞的14.32%，但在患者腫瘤組織中，它們的比例各不相同，平均占免疫細(xì)胞的26.42%（圖1G）。腫瘤組織中髓系細(xì)胞的增加表明這些細(xì)胞可能與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤進(jìn)展有關(guān)。隨后使用CellChat探索免疫細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間的通訊。與相鄰正常組織相比，腫瘤組織中髓系細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間的相互作用明顯不同（圖1H）。因此，我們重點(diǎn)關(guān)注髓系細(xì)胞，并根據(jù)先前的研究將這些細(xì)胞分為七個(gè)亞群，其中cDC1s、cDC2s、pDCs和單核細(xì)胞分別以BIRC3、CD1C、GZMB和S100A8的高表達(dá)為特征。還識(shí)別出了三種不同的巨噬細(xì)胞亞群——SPP1+巨噬細(xì)胞、MNDA+巨噬細(xì)胞和IGKC+巨噬細(xì)胞（圖1I，J）。有趣的是，MNDA+巨噬細(xì)胞和IGKC+巨噬細(xì)胞在相鄰正常樣本中富集，而SPP1+巨噬細(xì)胞在幾乎所有腫瘤樣本中都有所增加（圖1I）。這些結(jié)果表明，SPP1+巨噬細(xì)胞可能在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展中執(zhí)行不同的功能。

2）腫瘤特異性SPP1⁺ Macs與HNSCC不良預(yù)后呈正相關(guān)

在研究了腫瘤和相鄰正常組織之后，我們接下來(lái)調(diào)查了髓系細(xì)胞中SPP1的表達(dá)。火山圖和UMAP圖顯示，SPP1在髓系細(xì)胞中顯著上調(diào)，并且在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)（圖2A，B）。此外，SPP1+巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中的髓系細(xì)胞總數(shù)中占49.77%，而在相鄰正常組織的髓系細(xì)胞總數(shù)中僅占19.52%（圖2C）。免疫組化染色（MIHC）揭示，SPP1與CD68+細(xì)胞顯著共定位，并且SPP1在來(lái)源于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織的巨噬細(xì)胞中的表達(dá)高于來(lái)源于相鄰正常組織的巨噬細(xì)胞（圖2D，E）。SPP1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌腫瘤樣本中的表達(dá)顯著高于正?？谇簧掀そM織樣本（圖2F）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SPP1表達(dá)與TNM分期呈正相關(guān)（圖2G）。此外，SPP1的曲線下面積（AUC）為0.8495，這表明SPP1可能是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物（圖2H）。SPP1表達(dá)較高的患者生存率較低（圖2I）。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)的分析揭示了相同的發(fā)現(xiàn)，這表明SPP1+巨噬細(xì)胞與不良預(yù)后相關(guān)，且SPP1表達(dá)水平與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者的癌癥分期和腫瘤等級(jí)呈正相關(guān)（圖2J）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明SPP1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中上調(diào)，并且主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，這表明SPP1作為預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

3）SPP1⁺ Macs通過(guò)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)HNSCC進(jìn)展

為了評(píng)估SPP1+巨噬細(xì)胞對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)影響，我們將巨噬細(xì)胞分為兩個(gè)亞群，SPP1+巨噬細(xì)胞和其他所有巨噬細(xì)胞，并基于單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了GSVA。結(jié)果表明，與普通巨噬細(xì)胞相比，SPP1+巨噬細(xì)胞積極參與細(xì)胞因子的產(chǎn)生（圖3A）。因此，我們假設(shè)SPP1+巨噬細(xì)胞可能通過(guò)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。在這里，我們利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)在THP-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲減SPP1。在用PMA處理48小時(shí)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞后，通過(guò)western blotting和實(shí)時(shí)PCR分別測(cè)量了THP-1細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞中SPP1的蛋白質(zhì)和mRNA水平（圖3B）。為了研究SPP1+巨噬細(xì)胞對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的直接或間接影響，我們從SPP1陰性對(duì)照組（SPP1-NC；SPP1-NC THP-1細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞）和SPP1過(guò)表達(dá)組（SPP1-OE；SPP1-OE THP-1細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞）收集了細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于進(jìn)一步的間接培養(yǎng)HN6和CAL27細(xì)胞，同時(shí)使用另一個(gè)共培養(yǎng)模型來(lái)探索直接影響（圖3C）。與SPP1-NC相比，SPP1-OE在直接和間接培養(yǎng)系統(tǒng)中都促進(jìn)了HN6和CAL27細(xì)胞的增殖，而直接共培養(yǎng)系統(tǒng)強(qiáng)烈加速了頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖3D，E）。SPP1-OE顯著促進(jìn)了HN6和CAL27細(xì)胞的遷移（圖3F，G）。為了進(jìn)一步探索SPP1+巨噬細(xì)胞釋放哪些候選細(xì)胞因子作用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，我們使用了Luminex液相懸浮芯片檢測(cè)來(lái)比較SPP1-NC組和SPP1-OE組之間40種常見(jiàn)趨化性和炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)。與SPP1-NC組相比，SPP1-OE組中差異表達(dá)最高的5種細(xì)胞因子是MIF、CXCL8、CXCL5、TNF-α和IL-1β（圖3H, I）。隨后，我們使用ELISA測(cè)量了這些細(xì)胞因子在SPP1-NC組和SPP1-OE細(xì)胞組新鮮上清液中的濃度。結(jié)果表明，MIF、TNF-α和IL-1β是在SPP1-OE巨噬細(xì)胞中上調(diào)最顯著且高表達(dá)的基因（圖3J, K）。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們重點(diǎn)關(guān)注了這三種因素。

4）SPP1⁺ Mac衍生的TNF-α和IL-1β在體外加速HNSCC細(xì)胞的增殖和遷移

為了研究SPP1+巨噬細(xì)胞來(lái)源的TNF-α和IL-1β是否促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，用添加TNF-α和IL-1β的巨噬細(xì)胞上清液或VGX-1027處理腫瘤細(xì)胞，比較巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。MTT試驗(yàn)和共培養(yǎng)集落形成試驗(yàn)顯示，與SPP1-NC細(xì)胞組相比，SPP1-NC + rhTNF-α、SPP1-NC + rhIL-1β和SPP1-NC + rhTNF-α + rhIL-1β細(xì)胞組顯著增加了HN6和CAL27細(xì)胞的增殖（圖4A, B）。隨后，我們將VGX-1027添加到SPP1-NC和SPP1-OE組的上清液中以阻斷TNF-α和IL-1β的效果，發(fā)現(xiàn)SPP1-OE組的增殖率顯著降低，而SPP1-NC組的增殖率略有降低（圖4C, D）。結(jié)果表明，抑制巨噬細(xì)胞來(lái)源的TNF-α和IL-1β減少了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且SPP1-NC也表現(xiàn)出TNF-α和IL-1β的分泌。同樣，當(dāng)與SPP1-KD細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，rhTNF-α和rhIL-1β促進(jìn)了HNSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖4E, F），這表明TNF-α和IL-1β在SPP1+巨噬細(xì)胞中的功能與SPP1不同。傷口愈合和Transwell遷移試驗(yàn)顯示，SPP1-NC+rhTNF-α、SPP1-NC+rhIL-1β、SPP1+rhTNF-α+rhIL-1β、SPP1-KD+rhTNF-α或SPP1-KD+rhIL-1β處理強(qiáng)烈加速了這些細(xì)胞的遷移，而VGX-1027處理顯著減緩了HNSCC細(xì)胞的遷移（圖4G, H）。這些結(jié)果共同表明，TNF-α和IL-1β可能在SPP1+巨噬細(xì)胞促進(jìn)HNSCC細(xì)胞體外增殖和遷移的過(guò)程中發(fā)揮主要作用。

5）SPP1⁺ Macs分泌的TNF-α和IL-1β受NF-κB信號(hào)通路調(diào)控

在建立了SPP1+巨噬細(xì)胞與TNF-α和IL-1β之間的聯(lián)系之后，我們接下來(lái)研究了它們分泌的機(jī)制。我們對(duì)單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的GSVA揭示了SPP1+巨噬細(xì)胞與I kappa B/激酶nf-kappa B信號(hào)通路相關(guān)（圖3A）。因此，我們研究了NF-kappa B信號(hào)通路是否影響SPP1+巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β。我們用PDTC（一種選擇性的NF-kappa B抑制劑）預(yù)處理SPP1-NC和SPP1-OE巨噬細(xì)胞3小時(shí)，以評(píng)估SPP1-OE巨噬細(xì)胞的影響。與SPP1-NC巨噬細(xì)胞相比，SPP1-OE巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出p65和IκBα的磷酸化增加以及IκBα表達(dá)的減少。PDTC處理減弱了p65和IκBα的磷酸化（圖5A）。在SPP1-NC巨噬細(xì)胞中，p65主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，而在SPP1-OE巨噬細(xì)胞中，p65在細(xì)胞核中積累。經(jīng)過(guò)PDTC預(yù)處理后，p65保持在細(xì)胞質(zhì)中（圖5B）。共聚焦顯微鏡的結(jié)果也證實(shí)了這些結(jié)果，并表明NF-kappa B信號(hào)通路可能在SPP1+巨噬細(xì)胞中被激活（圖5C）。隨后，我們使用ELISA來(lái)確定PDTC抑制巨噬細(xì)胞中的NF-kappa B信號(hào)是否減少了TNF-α和IL-1β的分泌。PDTC顯著減少了SPP1-NC和SPP1-OE巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-1β（圖5D, E）。此外，MTT和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，用PDTC預(yù)處理巨噬細(xì)胞后，與這些巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的HN6和CAL27細(xì)胞的增殖和遷移被抑制（圖5F, G）。總之，我們的發(fā)現(xiàn)表明，SPP1+巨噬細(xì)胞通過(guò)激活NF-kappa B信號(hào)通路增加了TNF-α和IL-1β的分泌。

6）SPP1⁺ Mac衍生的TNF-α和IL-1β促進(jìn)巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中OPN的表達(dá)

為了進(jìn)一步探索SPP1+巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-1β如何促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展，我們將重組人TNF-α（rhTNF-α）和重組人IL-1β（rhIL-1β）單獨(dú)以及同時(shí)添加到HN6和CAL27腫瘤細(xì)胞中。先前的研究表明，TNF-α和IL-1β在不同細(xì)胞類型中激活PI3K/Akt、NF-κB、MAPK/Erk和STAT3信號(hào)通路。因此，我們檢測(cè)了哪個(gè)信號(hào)通路與TNF-α和IL-1β調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的能力相關(guān)。Western blot分析顯示，在HN6和CAL27細(xì)胞中，NF-κB信號(hào)通路被單獨(dú)的TNF-α和IL-1β以及TNF-α和IL-1β共同激活（圖6A）。此外，PDTC減少了TNF-α和IL-1β誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的增加（圖6B-E）。有趣的是，我們還觀察到當(dāng)腫瘤細(xì)胞用TNF-α或IL-1β處理時(shí)，OPN表達(dá)也會(huì)增加，而當(dāng)它們同時(shí)用TNF-α和IL-1β處理時(shí)，顯示出雙重效果（圖6A, F-G）。我們進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)，并使用PDTC抑制功能（圖6G, H）。結(jié)果顯示，TNF-α和IL-1β激活了NF-κB信號(hào)通路，然后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞中OPN表達(dá)和腫瘤細(xì)胞進(jìn)展。鑒于TNF-α和IL-1β促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞中OPN的表達(dá)，我們想知道TNF-α和IL-1β是否也促進(jìn)鄰近巨噬細(xì)胞中OPN的表達(dá)。當(dāng)巨噬細(xì)胞用TNF-α或IL-1β單獨(dú)處理或同時(shí)用TNF-α和IL-1β處理時(shí)，OPN在蛋白質(zhì)和mRNA水平上的表達(dá)均上調(diào)（圖6I）。然而，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-1β在巨噬細(xì)胞中激活了STAT3，但沒(méi)有激活NF-κB信號(hào)通路。在用TNF-α和IL-1β處理的巨噬細(xì)胞中使用Stattic（一種阻斷STAT3的藥物）減少了OPN表達(dá)（圖6J-L）。簡(jiǎn)而言之，SPP1+巨噬細(xì)胞來(lái)源的TNF-α和IL-1β促進(jìn)了巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中OPN的表達(dá)。

7）SPP1⁺ Macs促進(jìn)HNSCC在體內(nèi)的進(jìn)展

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SPP1+巨噬細(xì)胞對(duì)體內(nèi)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌生長(zhǎng)的影響，我們使用了HN6 HNSCC腫瘤細(xì)胞與從THP-1細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞按7:3比例混合的方法來(lái)建立小鼠模型。經(jīng)過(guò)VGX-1027或PDTC處理3小時(shí)后，將SPP1-NC、SPP1-OE、SPP1-KD、SPP1-OE + VGX-1027或SPP1-OE + PDTC細(xì)胞組皮下注射到裸鼠中（圖7A）。為了保持持久的效果，我們每隔3天圍繞腫瘤注射VGX-1027和PDTC。有趣的是，SPP1-KD、SPP1-OE + VGX-1027和SPP1-OE + PDTC組的腫瘤重量和體積顯著低于SPP1-NC組（圖7B-D）。在取出移植腫瘤后，進(jìn)行了IHC染色和多重免疫組化染色，以探索OPN、TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。兩種染色結(jié)果均表明，SPP1-OE、SPP1-OE + VGX-1027和SPP1-OE + PDTC組的OPN表達(dá)高于其他組。我們還發(fā)現(xiàn)，SPP1-OE + PDTC組的OPN表達(dá)低于其他兩組，這可能表明PDTC如我們之前所示抑制了腫瘤細(xì)胞中OPN的表達(dá)。TNF-α和IL-1β在SPP1-OE + VGX-1027和SPP1-OE + PDTC組的表達(dá)低于SPP1-OE組，甚至低于SPP1-NC組，此外，結(jié)果顯示OPN、TNF-α和IL-1β在SPP1-KD組的表達(dá)最低（圖7E, F）?？傊@些數(shù)據(jù)表明SPP1+巨噬細(xì)胞通過(guò)激活NF-kappa B信號(hào)通路分泌細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β來(lái)促進(jìn)HNSCC的進(jìn)展。

結(jié)論：

SPP1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞激活NF-kappa B途徑，增加TNF-α和IL-1β的分泌，這促進(jìn)了頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和遷移。我們還證明了TNF-α和IL-1β在腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中上調(diào)了OPN的表達(dá)；因此，這些因素可能成為通過(guò)增強(qiáng)抗腫瘤效果來(lái)提高療效的候選靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法：

單細(xì)胞測(cè)序，RT-PCR，Western blot，IHC，免疫熒光，mIHC，免疫細(xì)胞化學(xué)，芯片檢測(cè)，ELISA，MTT，克隆形成實(shí)驗(yàn)，transwell，傷口愈合實(shí)驗(yàn)，流式。

參考文獻(xiàn)：

Liu C, Wu K, Li C, Zhang Z, Zhai P, Guo H, Zhang J. SPP1+?macrophages promote head and neck squamous cell carcinoma progression by secreting TNF-α and IL-1β. J Exp Clin Cancer Res. 2024 Dec 26;43(1):332. doi: 10.1186/s13046-024-03255-w.