??腫瘤壞死因子（TNF）誘導的受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1 （RIPK1）介導的細胞死亡，包括細胞凋亡和壞死性凋亡，越來越被認為是炎癥性疾病的主要驅(qū)動因素。細胞死亡檢查點通常會抑制 RIPK1 激酶，以保護生物體免受其有害后果。然而，當保護性檢查點被禁用時，允許 RIPK1 激酶活性的機制仍不清楚。在這里，我們確定 S-棕櫚?；?nbsp;RIPK1 激酶的許可修飾。TNF 誘導 RIPK1 棕櫚?；?，由 DHHC5 介導，并依賴于 RIPK1 的 K63 連接泛素化，RIPK1 通過促進其激酶結(jié)構(gòu)域的同源相互作用來增強 RIPK1 激酶活性，并在細胞死亡檢查點阻斷后促進細胞死亡。此外，DHHC5 在患有代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎的小鼠肝臟中被脂肪酸擴增，導致在這種情況下觀察到的 RIPK1 細胞毒性增加。我們的研究結(jié)果表明，泛素化依賴性棕櫚酰化使 RIPK1 激酶活性能夠誘導下游細胞死亡信號傳導，并表明 RIPK1 棕櫚酰化是炎癥性疾病的可行靶點。本文于2024年11月發(fā)表于《Molecular Cell》，IF：19.3

??研究技術(shù)路線：??

??研究結(jié)果：??

1.RIPK1在 TNF 誘導的復合物 I 中 S- 棕櫚?；?/span>

我們著手確定復合物 I 組分是否是 S- 棕櫚?；磻?/span> TNF 感應。我們應用常用的?；锼亟粨Q(ABE)測定法來檢測 S- 棕櫚?；Ｔ摲椒ㄉ婕白钄嗟鞍踪|(zhì)中的游離半胱氨酸殘基，隨后使用羥胺(HAM)和硫醇反應性生物素釋放和捕獲棕櫚酰化半胱氨酸殘基。我們使用基于免疫沉淀法(IP)和 ABE 分析的棕櫚酰化蛋白富集，加上質(zhì)譜法，來鑒定復合物 I 中的 S-棕櫚酰化底物(圖1A)。我們在復合物 I 中鑒定了三種酰化蛋白，包括 RIPK1，TNFR1和 TAB3(圖1B)。使用2-溴棕櫚酸酯(2-BP)(一種常見的 PATs 抑制劑)可以實現(xiàn) S- 棕櫚?；奶禺愋砸种啤Ｖ挥?/span> RIPK1和 TNFR1對2-BP 治療敏感(圖1C)。我們專注于 RIPK1棕櫚酰化，因為 RIPK1棕櫚酰化的豐度顯著高于 TNFR1棕櫚?；?，TNFR1棕櫚?；耙延袌蟮?。

HEK293T 細胞中異位表達的 RIPK1被棕櫚?；?，在用2-BP 處理后減少(圖1D)。然后，我們使用炔標記的棕櫚酸類似物15-十六烷酸(Alk14)作為代謝標記，其可以與熒光染料四甲基羅丹明(TAMRA)-疊氮化合物或通過單擊化學與生物素疊氮化合物偶聯(lián)。在 Alk14的代謝摻入后異位表達的 RIPK1被棕櫚?；?圖1E)。相比之下，內(nèi)源性 RIPK1在基礎(chǔ)條件下不經(jīng)歷棕櫚酰化。然而，TNF 刺激顯著增加了小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)和骨髓來源的巨噬細胞(BMDMs)中的 RIPK1棕櫚?；?圖1F)。進一步的分析顯示，超過25% 的 RIPK1被棕櫚?；?，如?；垡叶?PEG)交換(APE)測定所示。

我們還觀察到 TNF 誘導的復合物 I 中棕櫚?；?nbsp;RIPK1顯著增加，由于復合物 I10中 RIPK1的已知泛素化，其顯示出高分子量的涂片模式(圖1G)。RIPK1的這種修飾在2-BP 處理后減少(圖1H) ，證實這些條帶確實是棕櫚?；慕Y(jié)果。我們還觀察到在 TNF 刺激的小鼠中，作為主要靶器官之一的肝組織中 RIPK1棕櫚?；脑黾?圖1I)。因此，RIPK1是 TNF 誘導的復合物 I 中蛋白 S- 棕櫚酰化的底物。

Figure 1 RIPK1在 TNF 刺激下棕櫚酰化

2.RIPK1在進化上保守的 Cys257處被棕櫚?；?/span>

我們還觀察到 TNF 誘導的復合物 I 中棕櫚?；?nbsp;RIPK1顯著增加，由于復合物 I10中 RIPK1的已知泛素化，其顯示出高分子量的涂片模式(圖1G)。RIPK1的這種修飾在2-BP 處理后減少(圖1H) ，證實這些條帶確實是棕櫚?；慕Y(jié)果。我們還觀察到在 TNF 刺激的小鼠中，作為主要靶器官之一的肝組織中 RIPK1棕櫚?；脑黾?圖1I)。因此，RIPK1是 TNF 誘導的復合物 I 中蛋白 S- 棕櫚?；牡孜?。

接下來，我們利用 CRISPR-Cas9技術(shù)產(chǎn)生 Ripk1C257S/C257S敲入小鼠。Ripk1C257S/C257S突變小鼠以正常的孟德爾比率出生，并且它們的生長看起來正常。來自 Ripk1C257S/C257S小鼠的初級 MEF 在 TNF 刺激下始終表現(xiàn)出有缺陷的 RIPK1棕櫚?；?圖2D 和2E)。此外，與 Ripk1WT/WT 小鼠相比，Ripk1C257S/C257S小鼠的肝組織中 TNF 誘導的 RIPK1棕櫚?；档?圖2F)。我們沒有觀察到 WT RIPK1和 C257S 突變體之間的熱穩(wěn)定性或二硫鍵形成模式的顯著差異，表明這種突變可能不會改變 RIPK1的整體折疊。

Figure 2 棕櫚?；ㄟ^增強其激酶結(jié)構(gòu)域的同源相互作用來促進 RIPK1激酶活性

3.棕櫚?；龠M復合物 I 中 RIPK1激酶的激活

我們接下來研究了棕櫚酰化是否影響 RIPK1向復合物 I 的募集。我們對復合物 I 進行了質(zhì)譜法分析，發(fā)現(xiàn)2-BP 不改變復合物 I 中 RIPK1的量，這通過免疫印跡證實(圖2G)。與 WT RIPK1相比，RIPK1的 C257S 突變體表現(xiàn)出與復合物 I 相當?shù)哪技?圖2H)。此外，2-BP 不影響復合物 I 中其他已知成分的水平。

RIPK1的激酶非依賴性激活可以通過 NF-κB 和 MAPK 途徑促進細胞存活; 或者，RIPK1的激酶激活可導致細胞死亡。阻斷 RIPK1棕櫚?；瘜?nbsp;TNF 刺激的 MEF 中 NF-κB 和 MAPK 信號傳導的激活沒有影響。我們接下來通過在 RIPK1(p-S166 RIPK1)上使用針對磷酸化 S166的抗體來評估 RIPK1棕櫚?；欠裼绊懫浼っ富钚?，RIPK1是其激酶活化的公認標志物。單獨的 TNF 可以激活復合物 I.41中的 RIPK1的非致死庫。在2-BP 處理的 MEF 或 Ripk1C257S/C257SMEF 中，p-S166 RIPK1的水平顯著降低,與各自的對照 MEF (圖2G 和2H)相比，表明棕櫚?；龠M復合物 I 中 RIPK1的激酶活化。鑒于 C257位于激酶結(jié)構(gòu)域(KD)中，我們推測該位點的棕櫚?；赡茉鰪?nbsp;RIPK1活性。RIPK1的過度表達可導致自發(fā)激酶活化。我們發(fā)現(xiàn)過表達 RIPK1-C257S 突變體導致與 WT 相比 p-S166 RIPK1水平較低，并且兩者都被 RIPK1激酶抑制劑 necrostatin-1s (Nec-1s)抑制。值得注意的是，C257S 突變本身不影響體外激酶測定中 RIPK1-KD 的活性，表明棕櫚?；{(diào)節(jié) RIPK1激酶的細胞特異性機制。

4.棕櫚?；龠M RIPK1-KD 的同源相互作用

RIPK1由 N- 末端 KD，中間結(jié)構(gòu)域(ID)和 C- 末端死亡結(jié)構(gòu)域(DD)組成。 RIPK1的激酶活化通過二聚體內(nèi)的反式自磷酸化發(fā)生，這可能是由其 KD 的同源結(jié)合介導的。眾所周知，DD 介導的二聚化對于 RIPK1的自體磷酸化和激活是必不可少的。然而，KD 如何實現(xiàn)同源相互作用以促進自體磷酸化仍然不清楚(圖2I)。我們觀察到異位表達的 RIPK1-KD 的同源相互作用，其通過2-BP 處理或 C257S 突變降低，表明棕櫚?；龠M RIPK1-KD 同源相互作用。相比之下，2-BP 處理對 RIPK1-DD 的同源相互作用沒有影響。我們進一步應用 NanoLuc 二元技術(shù)(NanoBiT) ，一種由結(jié)構(gòu)互補的大 BiT (LgBiT)和小 BiT (SmBiT)亞基組成的雙組分系統(tǒng)，可用于細胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)相互作用，以研究棕櫚?；瘜?nbsp;RIPK1-KD 同源相互作用的影響(圖2J)。N- 末端或 C- 末端 LgBiT 融合的 RIPK1的相互作用分別用 N- 末端或 C- 末端 SmBiT 融合的 RIPK1檢測，但不與陰性對照 SmBiT-HaloTag (圖2J)檢測，提示 RIPK1的同源相互作用。然而，2-BP 顯著降低了 LgBiT-RIPK1和 SmBiT-RIPK1之間的相互作用(圖2J) ，而對 RIPK1-LgBiT 和 RIPK1-SmBiT 之間的相互作用影響較小(圖 S2J) ，表明 LgBiT-RIPK1和 SmBiT-RIPK1之間的相互作用信號主要來源于 RIPK1-KD 同源相互作用。此外，LgBiT-RIPK1-C257S 和 SmBiT-RIPK1之間的相互作用顯著低于 LgBiT-RIPK1和 SmBiT-RIPK1之間的相互作用(圖2J)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在 RIPK1-DD 二聚化后，棕櫚?；瘜τ诖龠M RIPK1-KD 同源相互作用是重要的，從而促進了 RIPK1的自體磷酸化。

5.當保護性檢查點被禁用時，棕櫚?；?nbsp;RIPK1具有細胞毒性

我們接下來分析了 RIPK1棕櫚?；?nbsp;TNF 誘導的 RIPK1激酶介導的細胞死亡中的作用。已知有兩個檢查點可以抵消由 TNF 誘導的 RIPK1依賴性細胞死亡。第一個涉及通過激酶如 TGF-β 激活激酶1(TAK1) ，IκB 激酶 α/β (IKKα/β)和 TANK 結(jié)合激酶1(TBK1)磷酸化依賴性失活復合物 I 中的 RIPK1，阻止 RIPK1激酶依賴性細胞凋亡(RDA)。第二個檢查點涉及復合 IIa/b 中半胱天冬酶 -8依賴性的 RIPK1切割，防止 RIPK1激酶依賴性 necroptosis。我們觀察到通過 TNF 刺激聯(lián)合 TAK1抑制(T/5z7) ，IKKα/β 抑制(T/TPCA-1) ，TBK1抑制(T/MRT)或 TBK1缺陷可以通過2-BP 或 RIPK1-C257S 突變。RDA 涉及 RIPK1和半胱天冬酶的激活。2-BP 處理的 MEF 或 Ripk1C257S/C257S MEF 在 T/5z7刺激下顯示 RIPK1激酶活性降低和半胱天冬酶 -8介導的半胱天冬酶 -3切割(CC3)的抑制(圖3C 和3D)。用2-BP 或 RIPK1-C257S 突變處理也導致復合物 IIb 的形成減少。值得注意的是，RIPK1棕櫚?；皇芮?nbsp;RDA 刺激的影響。TNF 誘導的促存活基因的 NF-κB 依賴性上調(diào)保護細胞免受 RIPK1激酶非依賴性細胞凋亡(RIA)。放線菌酮(CHX)可阻斷 NF-κB 途徑下游的翻譯，從而促進 RIA，其不能被 Nec-1s 阻斷。2-BP 或 RIPK1-C257S 突變對 TNF/CHX 誘導的 MEF 死亡沒有影響，表明棕櫚?；?nbsp;RIA 中不起作用。

使用抑制劑如Z-Val-Ala-Asp-FMK (zVAD)抑制 caspase-8可誘導 TNF 刺激的細胞中 RIPK1激酶依賴性壞死。用 CHX 和 zVAD (T/C/Z)聯(lián)合治療 TNF 是可被 Nec-1s38,43抑制的 necroptosis 的完善模型(圖3E)。我們發(fā)現(xiàn)2-BP 或 RIPK1-C257S 突變顯著降低了細胞對 T/C/Z 誘導的 necroptosis 的敏感性(圖3E 和3F)。壞死也發(fā)生在用 TNF 和 zVAD 處理的細胞中，伴隨5z7(T/5z7/Z)抑制 TAK1,50也被2-BP 或 RIPK1-C257S 突變減少。此外，2-BP 處理的細胞或 Ripk1C257S/C257S 細胞對 necroptosis 誘導的敏感性降低通過 p-S166 RIPK1和壞死生物標志物 p-T231/S232 RIPK3和 p-S345 MLKL20,51(圖3G，3H)的降低進一步標志。最后，2-BP 或 RIPK1-C257S 突變導致壞死體形成減少。值得注意的是，RIPK1棕櫚?；皇艽賶乃烙|發(fā)因子的影響。RIPK1激酶依賴性細胞死亡嚴重參與介導 TNF 誘導的系統(tǒng)性炎癥反應綜合征(SIRS)。2-BP 或 RIPK1-C257S 敲入突變有效地保護小鼠免受致死劑量的 TNF 誘導的致死性(圖3I 和3J) ，進一步支持棕櫚?；诖龠M RIPK1細胞毒性中的作用。

當巨噬細胞中半胱天冬酶 -8被抑制時，RIPk1介導的 necroptosis 也可以在 Toll樣受體(LPS)刺激的脂多糖4(TLR4)途徑中觸發(fā)。引人注目的是，與相應的對照細胞相比，2-BP 處理的 BMDMs 或 Ripk1C257S/C257S BMDMs 顯示對由 LPS 聯(lián)合 zVAD (LPS/Z)誘導的 necroptosis 的敏感性降低。用 LPS/Z 刺激的 BMDM 中的2-BP 處理也降低了 p-S166 RIPK1，p-T231/S232 RIPK3和 p-S345 MLKL 的水平。總的來說，這些結(jié)果表明，RIPK1棕櫚?；S可其激酶活性和細胞毒性失活的細胞死亡檢查點。

Figure 3 棕櫚?；龠M RIPK1對細胞死亡檢查點的細胞毒性阻斷

6.DHHC5介導復合物 I 的 RIPK1棕櫚?；?/span>

在哺乳動物中，DHHC 家族由23個成員組成。我們使用短發(fā)夾 RNA (shRNA)敲低這23種 DHHC 蛋白在 MEF 中的表達，并鑒定了6種在敲低時抑制 RDA 和/或 necroptosis 的 PATs (Z 評分 > 1)(圖4A)。RIPK1與六個預選的 PATs 中的每一個的過度表達確定只有 DHHC5增強 RIPK1棕櫚?；４送?，DHHC5的缺失大大降低了異位表達的 RIPK1的棕櫚?；?。

在 DHHC5敲低的細胞中，但在其他 DHHC 敲低的細胞中，TNF 誘導的 RIPK1棕櫚酰化被消除。我們進一步通過在炔烴標記的棕櫚酰輔酶 A (CoA)(Alk14-CoA)存在下將純化的 RIPK1蛋白與 DHHC5溫育來進行體外棕櫚?；瘻y定。我們檢測了由 DHHC5催化的 RIPK1的體外棕櫚?；?，但不是通過在保守的 DHHC 基序(DHHS5)31(圖4C)內(nèi)含有 Cys-to-Ser 取代(C134S)的 DHHC5的催化失活突變體。當在體外棕櫚?；瘻y定中與 DHHC5和 Alk14-CoA 溫育時，RIPK1-C257S 突變體也表現(xiàn)出棕櫚酰化缺陷(圖4D)。與 WT 細胞相比，我們觀察到 DHHC5缺陷型細胞中復合物 I 中棕櫚?；?nbsp;RIPK1顯著減少(圖4E) ，表明 DHHC5對于 TNF 誘導的復合物 I 中的 RIPK1棕櫚?；潜匦璧?。

Figure 4 DHHC5介導 TNF 誘導的復合物 I 中 RIPK1棕櫚?；?/span>

7.DHHC5介導的棕櫚?；蕾囉?nbsp;K63連接的 RIPK1泛素化

RIPK1在復合物 I 中高度泛素化，作為多種蛋白質(zhì)復合物募集的支架。我們推測抑制 RIPK1泛素化是否可能影響其棕櫚?；?。在 TNF 感應后，RIPK1和其他復合物 I 組分迅速經(jīng)歷由 cIAP1/2介導的 K63和 K11連接的泛素化以及由線性泛素鏈組裝復合物(LUBAC，包含 HOIL-1，HOIP 和 SHARPIN)介導的線性泛素化。值得注意的是，復合物 I 中 RIPK1的棕櫚?；?nbsp;SM-164處理的 cIAP1/2消耗后被消除(圖4F)。然而，其中 LUBAC 功能失調(diào)的 Hoip-/-MEF 表現(xiàn)出與 WT MEF 相似程度的 RIPK1棕櫚酰化。這些結(jié)果表明 RIPK1棕櫚酰化依賴于 cIAP1/2介導的泛素化。與此相一致的是，2-BP 對 TNF 聯(lián)合 SM-164(T/S)或 T/S/Z 誘導的 necroptosis 誘導的 RDA 沒有影響。相比之下，已知 HOIP 缺陷使細胞對 RIPK1激酶依賴性細胞死亡敏感，但2-BP 仍然在 HOIP 缺陷型 MEF 中提供了對 RDA 和 necroptosis 的保護。CIAP1/2介導的 RIPK1的泛素化主要發(fā)生在復合物 I中的鼠 RIPK1(人 RIPK1的 K377)的 Lys376(K376)上。值得注意的是，表達 RIPK1-K376R 突變體的細胞顯示消除的棕櫚?；?圖4G) ，并且它們在 RDA 和 necroptosis 方面對2-BP 處理沒有反應。

我們觀察到在 TNF 處理的 MEF 中，RIPK1和 DHHC5之間的相互作用顯著增加，如通過鄰近連接測定(PLA)所確定的(圖4H)。因此，DHHC5和 RIPK1被招募到復合物 I 中。然而，在用 SM-164處理的細胞中，RIPK1和 DHHC5之間的 TNF 誘導的相互作用完全消除(圖4I) ，表明在 RIPK1上加入 cIAP1/2的泛素鏈促進 DHHC5的募集。CIAP1/2誘導 RIPK1的 K63和 K11連接的泛素化。我們發(fā)現(xiàn) DHHC5向復合物 I 的募集主要由 K63連接的泛素鏈介導(圖4J)。因此，cIAP1/2介導的 K63連接的 RIPK1泛素化促進 DHHC5募集至復合物 I，允許復合物 I 中 DHHC5介導的 RIPK1的棕櫚酰化(圖4K)。

8.DHHC5促進 TNF 誘導的 RIPK1激酶活化和細胞毒性

隨后我們研究了 DHHC5在促進 RIPK1激酶活化和細胞毒性中的作用。當細胞接受 TNF 刺激時，DHHC5缺陷導致復合物 I 中 p-S166 RIPK1的減少(圖5A)。結(jié)果，DHHC5缺陷細胞對 T/5z7誘導的 RDA 的敏感性降低(圖5B)。此外，DHHC5缺陷顯著降低了用 T/5z7處理的細胞中的 RIPK1和半胱天冬酶活化以及復雜的 IIb 形成(圖5C)。同樣，DHHC5缺陷細胞對 T/C/Z 誘導的壞死的敏感性顯著降低(圖5D)。一致的是，DHHC5缺陷導致用 T/C/Z 處理的細胞中 p-S166 RIPK1，p-T231/S232 RIPK3，p-S345 MLKL 和壞死體形成的減少(圖5E)。與棕櫚?；诖龠M RIPK1-KD 同源相互作用中的作用一致，DHHC5缺陷降低了 RIPK1的 KD-KD 相互作用(圖5F)。

綜上所述，這些結(jié)果建立了以下模型，說明 RIPK1激酶活化是如何被許可促進細胞毒性的(圖5G)。在 TNF 感應后，RIPK1被迅速募集到復合物 I 中，在那里它經(jīng)歷 cIAP1/2介導的 K63連接的泛素化，其促進 DHHC5的募集，其催化 RIPK1-KD 的棕櫚?；?。當細胞死亡檢查點被阻斷時，棕櫚酰化促進 RIPK1-KD 的同源相互作用并增強 RIPK1反式激活，最終導致細胞死亡。

Figure 5 DHHC5在細胞死亡檢查點阻斷時促進 RIPK1激酶活性和細胞毒性

9.DHHC5在 MASH 肝臟中通過脂肪酸擴增

以前的研究已經(jīng)將 RIPK1的細胞毒性與 MASH 聯(lián)系起來，其中肝臟積聚了過多的脂肪沉積物。然而，MASH 中 RIPK1激活的機制仍然難以捉摸。我們發(fā)現(xiàn)喂食膽堿缺陷型高脂飲食(CD-HFD)的小鼠可以迅速誘導 MASH 組織病理學，與正常脂肪飲食(ND)的小鼠相比，RIPK1棕櫚?；@著增加(圖6A)。與喂食 ND 的小鼠相比，喂食 CD-HFD 或常用 HFD 的小鼠的肝組織中 DHHC5的蛋白質(zhì)水平也升高(圖6B)。此外，與喂食 ND 的小鼠相比，喂食 CD-HFD 的小鼠的肝組織中 Dhhc5的 mRNA 水平顯著升高。

我們在 MASH 肝臟中觀察到 DHHC5在肝細胞中的特異性上調(diào)，但在非實質(zhì)(NPC)細胞中沒有(圖6C)。然后，我們用0.4 mM 棕櫚酸(PA)刺激原代肝細胞，在該濃度下進行以模擬脂肪肝疾病的體內(nèi)條件。我們觀察到 PA 處理后肝細胞中 Dhc5 mRNA 和蛋白質(zhì)水平的增加(圖6D)。此外，在 PA 處理的肝細胞中 TNF 誘導的 RIPK1棕櫚?；黾?。Dhc5的啟動子區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄因子 c-jun66的結(jié)合位點(圖 S6F)。已經(jīng)證實，PA 激活 c-Jun N- 末端激酶(JNKs) ，其磷酸化 c-Jun 并促進 MASH。我們假設(shè) PA 誘導的 DHHC5的轉(zhuǎn)錄激活是由 JNK/c-Jun 途徑介導的。一致認為，JNK 的藥理學抑制阻止了 PA 處理的肝細胞中 DHHC5的增加(圖6D)。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號傳導和 p38信號傳導在 MASH 肝臟和 PA 刺激的肝細胞中也被激活，這促進了 c-Jun 驅(qū)動的基因轉(zhuǎn)錄。一致地，抑制 ERK 或 p38信號傳導也降低了 PA 誘導的 DHHC5的表達。

我們通過使用被 JNK 抑制消除的染色質(zhì)免疫沉淀定量實時 PCR (ChIP-qPCR)觀察到 PA 處理的肝細胞中 DHHC5啟動子處 c-Jun 的強占據(jù)(圖6E)。然后，我們通過將 Dhhc5啟動子區(qū)與熒光素酶基因連接進行熒光素酶報告基因檢測(圖6F)。C-Jun 的過表達顯著增加了通過 Dhhc5啟動子的轉(zhuǎn)錄激活，但不是通過對照 CMV 啟動子或缺乏 c-Jun 結(jié)合位點的突變的 Dhhc5啟動子(圖6F)。因此，DHHC5通過 JNK/c-Jun 途徑在 MASH 肝細胞中被脂肪酸擴增。

Figure 6 脂肪酸擴增的 DHHC5促進 MASH 中 RIPK1驅(qū)動的肝損傷

10.脂肪酸擴增的 DHHC5促進 MASH 中 RIPK1驅(qū)動的肝損傷

接下來，我們通過將 Dhhc5f/f 小鼠與白蛋白 -Cre (Alb-Cre)轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，產(chǎn)生肝細胞特異性 Dhhc5敲除小鼠，并用 CD-HFD 喂養(yǎng)小鼠以誘導 MASH 相關(guān)的組織病理學。在來自 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠的原代肝細胞中，DHHC5缺陷顯著降低了棕櫚酰化 RIPK1的水平(圖6G)。與以前的研究一致，我們觀察到通過 p-S166 RIPK1免疫染色確定的 RIPK1激酶活性增加，并且通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標記(TUNEL)染色觀察到細胞死亡，在 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠的肝切片中，與 ND 喂養(yǎng)的小鼠相比。CD-HFD 喂養(yǎng)的 Dhhc5f/f； Alb-Cre 小鼠的肝臟中 p-S166 RIPK1和 TUNEL 陽性細胞的量減少(圖6H)。與這一發(fā)現(xiàn)一致，在 CD-HFD 喂養(yǎng)的 dhc5f/f; Alb-Cre 小鼠(圖6I)中，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平顯著降低，這是肝損傷的兩個常見標志物。

蘇木精和伊紅(H & E)和油紅 O (ORO)染色顯示，與 Dhhc5f/f 小鼠相比，CD-HFD 喂養(yǎng)的 Dhc5f/f; Alb-Cre 小鼠的肝脂肪變性和脂質(zhì)積累沒有改變。這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究一致，表明抑制 RIPK1激酶不影響 CD-HFD 模型中的肝脂肪變性，其刺激嚴重的 MASH 病理學。相比之下，我們觀察到 CD-HFD 喂養(yǎng)的 Dhhc5f/f; Alb-Cre 小鼠與 Dhc5f/f 小鼠相比，通過染色巨噬細胞標志物 CD45(圖6J)測量。DHHC5缺陷也導致促炎細胞因子 Tnf 和 Il6以及趨化性細胞因子 Ccl2，Ccl5和 Cxcl1的下調(diào)(圖6K)。此外，與對照小鼠相比，通過 Masson 三色染色(MTS)和天狼星紅染色評估的肝纖維化在 CD-HFD 喂養(yǎng)的 Dhc5f/f; Alb-Cre 小鼠中減少(圖6L)。與纖維化減少一致，dhHC5缺乏下調(diào)膠原基因 Col1a1，纖維化生長因子 Pdgfa，Pdgfb 和受體 Pdgfra 的表達(圖6M)。當用 Nec-1s 處理這些小鼠時，DHHC5缺陷對 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠的肝損傷的影響受到損害(圖6N) ，表明 DHHC5通過 RIPK1激酶依賴性方式在促進 MASH 中的肝損傷中起作用。

11.缺陷型 RIPK1棕櫚?；纳?nbsp;MASH 肝損傷

與 DHHC5缺陷小鼠類似，與 Ripk1WT/WT 小鼠相比，CD-HFD 喂養(yǎng)的 Ripk1C257S/C257S小鼠的肝臟中的肝脂肪變性沒有改變。然而，在 CD-HFD 喂養(yǎng)的 Ripk1C257S/C257S小鼠的肝臟中，RIPK1激活和細胞死亡被有效抑制(圖7A)。因此，在 CD-HFD 喂養(yǎng)后，與 WT 小鼠相比，Ripk1C257S/C257S小鼠血清 ALT 和 AST 水平顯著降低(圖7B)。RIPK1-C257S 突變也導致炎癥反應顯著降低，如 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠肝臟中巨噬細胞浸潤減少和細胞因子和趨化因子下調(diào)所示(圖7C 和7D)。此外，CD-HFD 喂養(yǎng)后，組織學纖維化顯著降低，Ripk1C257S/C257S小鼠的肝臟中的纖維化基因譜紊亂也得到改善(圖7E 和7F)。此外，當用 Nec-1s 處理這些小鼠時，RIPK1-C257S 突變對 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠的肝損傷的影響受到損害(圖7G) ，進一步表明 RIPK1棕櫚?；诖龠M體內(nèi) RIPK1細胞毒性中的重要性。

Figure 7 RIPK1棕櫚?；毕轀p輕 MASH 相關(guān)性肝損傷

12.靶向 DHHC5對小鼠 MASH 的治療作用

我們接下來評估了靶向 DHHC5對 MASH 相關(guān)性肝損傷小鼠的潛在治療作用。我們產(chǎn)生了編碼靶向肝靶向治療基因載體 DHHC5(71)的短發(fā)夾 microRNA 的腺相關(guān)病毒8(AAV8) ，以誘導 MASH 肝細胞中的 DHHC5敲低。我們用 CD-HFD 喂養(yǎng)小鼠4周以建立 MASH，然后靜脈注射 AAV-shDhc5的小鼠，同時繼續(xù) CD-HFD 4周。在 AAV 感染4周后，我們在 AAV-shDhc5小鼠的肝臟中檢測到大量的 DHHC5減少。DHHC5敲低不影響 CD-HFD 喂養(yǎng)的小鼠的肝脂肪變性。盡管如此，DHHC5敲低顯著降低了 CD-HFD 喂養(yǎng)小鼠肝切片中 RIPK1的活化和細胞死亡。此外，與 AAV-shNC 小鼠相比，AAV-shDhc5小鼠血清 ALT 和 AST 水平顯著降低。DHHC5敲低也減輕了巨噬細胞浸潤和肝臟炎癥。此外，AAV-shDhhc5注射液顯著抑制組織學肝纖維化和促纖維化標志物的表達。這些結(jié)果表明，靶向 DHHC5可以減輕 MASH 相關(guān)的肝損傷。

研究結(jié)論：

因此，預防肝損傷和肝纖維化是 MASH 治療的一個主要目標，可以通過改善肝臟死亡來實現(xiàn)。因此，我們的研究具有潛在的臨床意義，并提出 DHHC5和 RIPK1棕櫚?；鳛楦唧w治療 MASH 相關(guān)性肝損傷的可行靶點。

實驗方法

基因表達數(shù)據(jù)分析、啟動子序列分析、基因編輯與突變、體外激酶檢測、熒光素酶報告基因?qū)嶒?、免疫共沉淀（IP）和免疫印跡（IB）、細胞培養(yǎng)與處理、細胞毒性分析、蛋白-蛋白相互作用檢測、代謝標記與熒光檢測、免疫熒光與共定位分析、小鼠模型、組織學染色評估肝脂肪變性和纖維化、檢測血清中肝損傷標志物水平

參考文獻：

Zhang N, Liu J, Guo R, Yan L, Yang Y, Shi C, Zhang M, Shan B, Li W, Gu J, Xu D. Palmitoylation licenses RIPK1 kinase activity and cytotoxicity in the TNF pathway. Mol Cell. 2024 Nov 21;84(22):4419-4435.e10. doi: 10.1016/j.molcel.2024.10.002. Epub 2024 Oct 28. PMID: 39471814.

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