最近的觀察顯示，H3K27cr在結(jié)直腸癌（CRC）組織中上調(diào)；然而，根本原因仍然難以捉摸。本研究旨在探討H3K27cr上調(diào)的機制及其在CRC轉(zhuǎn)移中的作用。臨床上，我們的研究結(jié)果表明，H3K27cr是區(qū)分結(jié)直腸癌組織與健康對照的高度準確的診斷標志物。升高的LINC00887和H3K27cr水平與CRC患者較差的預后相關。在功能上，LINC00887和H3K27cr促進了CRC細胞的遷移和侵襲。機制上，LINC00887與SIRT3蛋白相互作用。LINC00887過表達阻斷了GCN5啟動子內(nèi)SIRT3的富集，從而使該區(qū)域的H3K27ac水平升高，而H3K27cr水平未升高，進而激活GCN5的表達。這種激活提高了H3K27cr的總體水平，促進了GCN5、H3K27cr和YEATS2在ETS1啟動子內(nèi)的富集，激活了ETS1的轉(zhuǎn)錄，最終促進了CRC的轉(zhuǎn)移。體內(nèi)研究表明，抑制LINC00887可抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移，但當小鼠接受NaCr治療時，這種抑制作用被消除?？傊?，我們的研究結(jié)果證實了H3K27cr在結(jié)直腸癌個體中的診斷生物標志物潛力，并提出了一個功能模型來闡明LINC00887通過提高H3K27cr水平參與促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。本文于2024年10月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

技術路線：

結(jié)果：

1）H3K27cr水平高與預后不良相關

我們檢測了97名結(jié)直腸癌患者癌組織及58名患者癌旁組織中H3K27cr的水平。結(jié)果顯示，癌組織的H3K27cr水平高于正常組織（圖1A-C）。我們研究了H3K27cr在區(qū)分結(jié)直腸癌組織與健康對照組中的潛在診斷價值。值得注意的是，ROC曲線分析顯示曲線下面積（AUC）值為0.9（圖1D）。此外，在我們之前的研究隊列中重復了這一分析，得到的AUC值為0.81（圖1E）。我們還評估了H3K27cr在區(qū)分遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者與無遠處轉(zhuǎn)移患者中的診斷價值，得到的AUC值為0.84（圖1F）。進一步地，H3K27cr顯示出區(qū)分轉(zhuǎn)移部位與原發(fā)結(jié)直腸癌組織的能力，AUC值為0.75（圖1G）。特別值得注意的是，在伴有淋巴結(jié)侵犯的結(jié)直腸癌患者中，H3K27cr水平升高者的預后較差（圖1H）。

2）LINC00887提高H3K27cr水平

接下來，我們研究了lncRNAs是否調(diào)節(jié)H3K27cr修飾。我們從TCGA數(shù)據(jù)集中識別了結(jié)腸腺癌（COAD）中差異表達的基因，或者使用激光顯微切割技術獲得的結(jié)直腸癌患者的上皮細胞中的差異表達基因（GSE15960）。研究發(fā)現(xiàn)，在COAD組織和從結(jié)直腸癌細胞衍生的上皮細胞中分別有1573和4241個基因差異表達。將這兩個結(jié)果結(jié)合起來，發(fā)現(xiàn)了298個差異表達的基因，包括五個lncRNAs（圖2A）。使用GSEA分析檢查這五個lncRNAs與具有被H3K27cr占據(jù)的啟動子的基因之間的關聯(lián)。這些發(fā)現(xiàn)表明，具有被H3K27cr占據(jù)的啟動子的基因在上皮細胞或COAD組織中高表達LINC00887的情況下顯著富集（圖2B, C）。隨后，對來自單細胞轉(zhuǎn)錄譜的上皮細胞進行了類似分析。檢查了來自GSE110009數(shù)據(jù)集的總共8083個細胞，識別出15個不同的細胞亞型（圖2D）。具有被H3K27cr占據(jù)的啟動子的基因在上皮細胞和Th0細胞中富集（圖2E）。GSEA結(jié)果顯示，在上皮細胞中高表達LINC00887的情況下，具有被H3K27cr占據(jù)的啟動子的基因顯著富集，但在Th0細胞中則不然（圖2F）。接下來，我們通過qRT-PCR檢測伴有淋巴結(jié)侵犯的結(jié)直腸癌患者中LINC00887的表達。結(jié)果表明，高LINC00887表達與預后不良顯著相關（圖2G）。Spearman相關性分析顯示LINC00887與H3K27cr水平之間存在正相關關系（圖2H）。LINC00887過表達增加了H3K27cr水平（圖2I）。相反，短暫和穩(wěn)定的LINC00887敲減產(chǎn)生了相反的效果（圖2J, K）。這些發(fā)現(xiàn)為LINC00887促進H3K27cr水平提供了證據(jù)。

3）LINC00887通過誘導GCN5表達提高H3K27cr水平

接下來，我們研究了LINC00887增加H3K27cr的機制。GCN5在結(jié)直腸癌組織中顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定和短暫的敲低LINC00887會降低GCN5的表達，而過表達LINC00887會提高GCN5的表達水平（圖3A-C）。此外，一項涉及LINC00887質(zhì)粒和siGCN5共轉(zhuǎn)染的拯救實驗恢復了H3K27cr水平（圖3D）。隨后，我們研究了GCN5啟動子組蛋白H3K27修飾的改變。結(jié)果顯示，LINC00887過表達上調(diào)了該區(qū)域的H3K27ac水平，但沒有上調(diào)H3K27cr水平（圖3E）。為了研究LINC00887影響GCN5啟動子上H3K27ac富集的分子機制，我們初步檢測了LINC00887在CRC細胞中的定位，揭示了主要的核定位。因此，我們假設LINC00887是否通過與乙?；嚓P酶的相互作用調(diào)控GCN5啟動子上H3K27ac的富集。隨后，進行RIP實驗以鑒定與LINC00887相互作用的蛋白。結(jié)果顯示SIRT3和LINC00887之間存在顯著的相互作用（圖3F）。這種相互作用通過RNA-FISH實驗進一步證實，顯示它們在細胞核中共定位（圖3G）。我們還觀察到，LINC00887過表達降低了GCN5啟動子中SIRT3的富集，而LINC00887敲低則增加（圖3H）。這些發(fā)現(xiàn)表明LINC00887與SIRT3相互作用。它的過表達阻礙了SIRT3與GCN5啟動子的結(jié)合，使該區(qū)域的H3K27ac水平升高，激活GCN5轉(zhuǎn)錄，最終使H3K27cr水平升高。

4）H3K27cr調(diào)節(jié)CRC組織上皮細胞的細胞粘附

我們研究了H3K27cr在調(diào)節(jié)侵襲中的作用機制。我們用NaCr處理結(jié)直腸癌細胞，并觀察到侵襲和遷移能力的增強（圖4A, B）。隨后，我們分析了Liao等人報道的具有被H3K27cr占據(jù)的啟動子的基因的功能通路。共富集了20個通路，包括細胞間粘附通路。接著，進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析，以評估這些20個通路在特定細胞類型中的存在情況。在GSE163974數(shù)據(jù)集中分析了總共1,688個細胞，識別出八個不同的細胞亞型（圖4C）。通過比較不同細胞亞型中的20個通路，觀察到細胞間粘附通路在來自結(jié)直腸癌組織的上皮細胞中特異性富集（圖4D）。這一結(jié)果在之前分析過的GSE221575數(shù)據(jù)集中得到了進一步證實（圖4E）。用NaCr處理的結(jié)直腸癌細胞減少了E-鈣粘蛋白，同時誘導了N-鈣粘蛋白的表達（圖4F, G）。這一發(fā)現(xiàn)暗示H3K27cr可能通過其對細胞粘附的影響，在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

5）LINC00887促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲和遷移

考慮到LINC00887對H3K27cr水平的促進作用，我們研究了LINC00887對加速侵襲和遷移的影響。研究結(jié)果顯示，LINC00887過表達增加了CRC細胞的侵襲和遷移水平，而立即和持續(xù)敲低LINC00887可降低這些水平（圖5A-C）。此外，立即和持續(xù)敲低LINC00887可上調(diào)E-cadherin的表達，下調(diào)N-cadherin和vimentin的表達，而過表達LINC00887則對這些標記物具有相反的作用（圖5D-F）。這些結(jié)果表明，LINC00887促進了CRC細胞的侵襲和遷移。

6）LINC00887通過H3K27cr介導的細胞粘附分子促進侵襲和遷移

我們研究了LINC00887是否通過H3K27cr調(diào)節(jié)侵襲和遷移。我們在HCT116細胞中進行了拯救實驗，實驗中轉(zhuǎn)染了siLINC00887并使用了10mM NaCr處理。結(jié)果顯示，NaCr處理恢復H3K27cr水平后，侵襲和遷移水平以及E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和波形蛋白的水平也得到了恢復（圖6A, B）。此外，拯救實驗表明，GCN5敲減恢復了LINC00887調(diào)節(jié)的E-鈣粘蛋白和波形蛋白水平（圖6C），這表明LINC00887通過GCN5/H3K27cr途徑調(diào)節(jié)結(jié)直腸細胞的侵襲和遷移。接下來，使用WGCNA在來自正常和結(jié)直腸癌組織的上皮細胞中識別了91個共表達模塊（圖6D）。在這些模塊中，有8個模塊在結(jié)直腸癌來源的上皮細胞中表達降低，而16個模塊表達增加（圖6E）。有10個模塊中的基因與EMT通路基因顯著相關。其中兩個模塊與602個基因表現(xiàn)出強烈的關聯(lián)（圖6F）。我們對GSE110009數(shù)據(jù)庫中602個以上的單細胞基因進行了mapping分析。分析顯示，它們在正常、結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移組織的B細胞和上皮細胞中顯著富集（圖6G， H）。隨后，對這602個基因的生物學途徑進行了注釋。結(jié)果表明，83條通路至少包含5個基因。在上皮細胞中比較這83種通路發(fā)現(xiàn)，CAMs在來自轉(zhuǎn)移組織的上皮細胞中表現(xiàn)出特異性富集（圖6I）。值得注意的是，這一結(jié)果在之前分析過的GSE225857數(shù)據(jù)集中得到了證實（圖6J）。這些發(fā)現(xiàn)表明，LINC00887通過H3K27cr調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移組織上皮細胞的CAMs通路。

7）LINC00887通過提高YEATS2的募集來促進ETS1的表達

ETS1調(diào)節(jié)CAMs基因的表達。我們接下來研究了LINC00887是否影響ETS1的表達。我們的觀察發(fā)現(xiàn)，LINC00887過表達增加了ETS1的水平，而LINC00887敲減則表現(xiàn)出相反的效果（圖7A–D）。此外，通過共轉(zhuǎn)染HCT116細胞LINC00887質(zhì)粒和siETS1進行了拯救實驗，發(fā)現(xiàn)ETS1敲減恢復了侵襲和遷移的水平，以及E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達（圖7E, F），這表明LINC00887通過ETS1調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移。接下來，我們研究了LINC00887對ETS1的調(diào)控機制。我們發(fā)現(xiàn)ETS1表達依賴于NaCr濃度，隨著NaCr濃度的增加，ETS1表達也增加（圖7G）。因此，對ETS1啟動子的分析顯示，LINC00887過表達增加了GCN5、YEATS2和H3K27cr在這一區(qū)域的富集。相反，LINC00887敲減產(chǎn)生了相反的效果（圖7H–J）。拯救實驗顯示，GCN5或YEATS2敲減恢復了LINC00887調(diào)節(jié)的ETS1表達（圖7K）?？偟膩碚f，結(jié)果表明LINC00887增強了ETS1啟動子中GCN5、H3K27cr和YEATS2的富集，激活了ETS1表達。

8）體內(nèi)抑制LINC00887可抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

最后，我們在體內(nèi)研究了LINC00887在調(diào)節(jié)CRC轉(zhuǎn)移中的作用（圖8A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制LINC00887能有效抑制HCT116細胞的轉(zhuǎn)移。然而，當用NaCr處理小鼠時，這種抑制作用被消除（圖8B， C）。此外，觀察到抑制LINC00887降低了GCN5， H3K27cr和vimentin水平。用NaCr處理后，這些減少被逆轉(zhuǎn)（圖8D， E）?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果表明，LINC00887和SIRT3之間的相互作用使SIRT3從GCN5啟動子中移位。這種位移增加了GCN5啟動子處的H3K27ac水平，激活了GCN5的表達，提高了H3K27cr的總體水平。因此，GCN5向ETS1啟動子的募集增強，提高了該區(qū)域的H3K27cr水平。這種增強的富集進一步促進了YEATS2的募集，增加了ETS1的表達和CRC轉(zhuǎn)移（圖8F）。

結(jié)論：

LINC00887過表達促進GCN5募集到ETS1啟動子，導致H3K27cr富集并被YEATS2識別。最終，這一事件級聯(lián)導致ETS1轉(zhuǎn)錄增強和CRC轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)支持了LINC00887和H3K27cr在促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用。

實驗方法：

單細胞測序，Western blotting，qRT-PCR，Transwell，ChIP-seq，ChIP-qPCR，RIP，FISH，IHC。

參考文獻：

Liao M, Zheng W, Wang Y, Li M, Sun X, Liu N, Yao J, Dong F, Wang Q, Ma Y, Mou J. LINC00887 promotes GCN5-dependent H3K27cr level and CRC metastasis via recruitment of YEATS2 and enhancing ETS1 expression. Cell Death Dis. 2024 Sep 30;15(9):711. doi: 10.1038/s41419-024-07091-w.