銅死亡（cuproptosis）是由銅離子濃度過(guò)高引起的一種現(xiàn)象，被緊急地開(kāi)發(fā)為潛在的癌癥治療方法。然而，腫瘤中銅死亡的啟動(dòng)、傳播和最終執(zhí)行機(jī)制尚不清楚。在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)在胃癌（GC）中，特別是在惡性腫瘤中，銅含量顯著升高。篩選發(fā)現(xiàn)，METTL16，一種非典型的甲基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)對(duì)FDX1 mRNA進(jìn)行m6A修飾，在銅死亡中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。此外，銅應(yīng)激促進(jìn)METTL16在K229位點(diǎn)的乳酸化，隨后引發(fā)銅死亡。METTL16的乳酸化過(guò)程受SIRT2的抑制。提高的METTL16乳酸化顯著提高了銅離子載體elesclomol的治療效果。將elesclomol與SIRT2特異性抑制劑AGK2結(jié)合使用，在體內(nèi)外誘導(dǎo)了胃腫瘤的銅死亡。這些結(jié)果揭示了非組蛋白蛋白質(zhì)METTL16乳酸化對(duì)腫瘤中銅死亡的重要性。鑒于GC中銅和乳酸濃度較高，誘導(dǎo)銅死亡成為一種有前景的GC治療策略。該研究于2023年10月發(fā)表于《Nature Communications》上，題為“Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer”，影響因子16.6。

技術(shù)路線(xiàn)

研究方法

1.  胃癌中銅含量較高并與腫瘤進(jìn)展相關(guān)

          銅死亡是由過(guò)高的銅濃度引起的，但腫瘤中銅死亡的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。鑒于銅主要通過(guò)胃和上消化道吸收，因此，胃腸系統(tǒng)腫瘤適合研究銅死亡的啟動(dòng)和傳播。作者分析了48對(duì)胃癌組織和相鄰組織中的銅濃度，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的銅濃度高于正常胃組織（圖1a，P < 0.01）。進(jìn)一步分析顯示，III期胃癌患者中的相對(duì)銅含量高于I期和II期胃癌患者（圖1b，P < 0.05），表明銅含量與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。此外，銅含量與胃癌患者的總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS）呈負(fù)相關(guān)（圖1c, d; log-rank P < 0.05）。同時(shí)，銅含量與細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)（圖1e）。同樣，患者血清標(biāo)本中的銅含量與血小板/淋巴細(xì)胞比值和中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值呈正相關(guān)，這兩者都是與胃癌侵襲性惡性腫瘤相關(guān)的炎癥預(yù)后生物標(biāo)志（圖1f, g)。這些結(jié)果表明高銅含量參與了胃癌的進(jìn)展和發(fā)展。

          此外，作者對(duì)不同類(lèi)型的胃癌，特別是惡性腫瘤類(lèi)型中銅濃度的差異進(jìn)行了研究。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)粘液腺癌的銅濃度高于總體胃腫瘤（圖1h）。在粘液腺癌中，銅含量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖1i）和血管侵襲（圖1j）等侵襲指標(biāo)呈正相關(guān)。然而，在非粘液腺癌中，銅含量與這些侵襲指標(biāo)或腫瘤分化無(wú)顯著相關(guān)性。粘液腺癌是胃癌的一種罕見(jiàn)組織學(xué)亞型，與更晚期和較差的5年總生存期和無(wú)病生存期相關(guān)39。作為難治性胃癌，粘液腺癌以化療放療耐藥性為特征，迫切需要更有效的治療方法。

          最近，研究人員發(fā)現(xiàn)高胞內(nèi)銅濃度會(huì)觸發(fā)一種還原酶FDX1將Cu2+還原為更具毒性的Cu1+，導(dǎo)致銅死亡11。作者發(fā)現(xiàn)與正常胃組織相比，胃癌中FDX1蛋白水平較高（圖1k）?？紤]到胃癌中FDX1蛋白水平和銅含量都較高，銅死亡可能更容易被觸發(fā)。這為胃癌提供了潛在的治療策略，特別是對(duì)于惡性腫瘤——粘液腺癌。

圖1 胃癌中銅含量較高并與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。

2.  METTL16是銅死亡的重要介導(dǎo)因子

          已經(jīng)報(bào)道與良性胃疾病和健康對(duì)照組相比，胃癌組中總m6A水平顯著增加，并促進(jìn)了胃癌的腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、轉(zhuǎn)移，甚至多藥耐藥過(guò)程。此外，m6A修飾參與了幾種細(xì)胞死亡類(lèi)型，包括凋亡、壞死, 鐵死亡和火死亡。然而，m6A修飾與銅死亡之間的關(guān)系仍不明確。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)胃癌組織中銅含量與總m6A水平呈正相關(guān)（R = 0.5116）。此外，銅顯著上調(diào)了胃癌細(xì)胞中總m6A修飾水平。鑒于甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白（METTL）家族在促進(jìn)m6A修飾中起主導(dǎo)作用，作者分析了METTLs敲除細(xì)胞在以1:1比例處理elesclomol/disulfiram和銅時(shí)的存活率。結(jié)果表明，METTL16敲除導(dǎo)致對(duì)elesclomol/disulfiram-Cu治療的耐藥性。此外，使用硫代硫氧鉬酸銅（TTM），一種銅死亡抑制劑，抑制了對(duì)照組和METTL16敲除細(xì)胞中的銅死亡，表明METTL16參與了銅死亡。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，成功構(gòu)建并驗(yàn)證了METTL16敲除克隆細(xì)胞系，觀(guān)察到了與METTL16敲除細(xì)胞相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明METTL16在銅死亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

圖2 METTL16是銅死亡的重要介導(dǎo)因子

          METTL16是一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，可以修飾多種前序和非編碼RNA，促進(jìn)翻譯和癌變，并且是癌癥治療的一個(gè)重要潛在靶點(diǎn)。通過(guò)TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中METTL16的mRNA水平相對(duì)較高，而在腫瘤周?chē)M織中較低。免疫組化（IHC）評(píng)分結(jié)果也顯示，胃癌組織中METTL16蛋白水平顯著高于正常胃組織。此外，METTL16蛋白水平與TNM分期、病理模式、神經(jīng)侵襲或血管侵襲無(wú)關(guān)。有趣的是，高METTL16蛋白水平的胃癌患者的總生存期（OS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存期（DFS）顯著增加，這與之前的研究結(jié)果一致，暗示高METTL16蛋白水平對(duì)腫瘤具有潛在的毒性作用。

3.  METTL16通過(guò)靶向FDX1促進(jìn)了銅死亡

          METTL16負(fù)責(zé)在許多轉(zhuǎn)錄本中進(jìn)行m6A沉積。因此，作者對(duì)穩(wěn)定的對(duì)照-Sh和METTL16-Sh細(xì)胞系進(jìn)行了甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）測(cè)序（圖3a）。MeRIP-seq的metagene圖顯示，在METTL16-Sh細(xì)胞中m6A含量減少。使用HOMER軟件預(yù)測(cè)了每個(gè)樣本中潛在的m6A修飾，并發(fā)現(xiàn)m6A修飾主要映射到經(jīng)典的GGAC基序（圖3b）。作者進(jìn)一步分析了根據(jù)MeRIP-seq結(jié)果mRNA的總m6A分布模式，發(fā)現(xiàn)m6A峰主要富集在CDS和3'UTR區(qū)域。KEGG通路分析表明，被METTL16甲基化的基因主要與癌癥通路相關(guān)。GO富集分析顯示，被METTL16修飾的基因富集了與線(xiàn)粒體通路相關(guān)的前15個(gè)通路（圖3c）。此外，作者鑒定了10個(gè)與銅死亡相關(guān)通路的典型因子，這些因子與低m6A甲基化水平以及METTL16-Sh組中下調(diào)的mRNA水平相關(guān)（圖3d）。qPCR分析顯示，METTL16-sh細(xì)胞中FDX1、MTF1、PDHB、ATP7A和DLD的mRNA水平下調(diào)，其中FDX1在METTL16-sh細(xì)胞中表現(xiàn)出最顯著的mRNA水平下調(diào)（圖3e）。此外，在METTL16-Sh或-KO細(xì)胞中檢測(cè)到FDX1蛋白水平的顯著下調(diào)（圖3f,g）?？紤]到FDX1是銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，作者推測(cè)METTL16誘導(dǎo)的銅死亡依賴(lài)于FDX1。

          接下來(lái)，作者評(píng)估了METTL16是否通過(guò)影響FDX1的表達(dá)來(lái)調(diào)控銅死亡。鑒于蛋白質(zhì)硫辛酸化是銅死亡的關(guān)鍵元素，作者評(píng)估了METTL16敲除對(duì)蛋白質(zhì)硫辛酸化的影響，使用硫辛酸特異性抗體作為DLAT硫辛酸化的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，METTL16敲除導(dǎo)致DLAT硫辛酸化減少，通過(guò)免疫印跡進(jìn)行測(cè)量（圖3h）。此外，在elesclomol/disulfiram-Cu處理后，FDX1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了METTL16敲除和敲除細(xì)胞系中銅死亡的拮抗作用（圖3i, j）。METTL16過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的銅死亡通過(guò)FDX1敲除得到抑制（圖3k）?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明，METTL16通過(guò)靶向FDX1促進(jìn)了銅死亡的發(fā)生。

圖3 METTL16通過(guò)靶向FDX1促進(jìn)了銅死亡的發(fā)生

4.  METTL16通過(guò)m6A修飾在FDX1 mRNA上促進(jìn)FDX1蛋白的積累

          為進(jìn)一步探索METTL16如何調(diào)控m6A修飾并影響FDX1 mRNA水平，進(jìn)行了基因特異性MeRIP-qPCR實(shí)驗(yàn)。作者發(fā)現(xiàn)，在METTL16敲除和敲除細(xì)胞中，FDX1 mRNA上的m6A水平顯著降低，而在轉(zhuǎn)染METTL16過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中顯著增加（圖4a, b）。當(dāng)用放線(xiàn)菌D（ActD）停止轉(zhuǎn)錄時(shí)，FDX1 mRNA在METTL16敲除細(xì)胞中的降解速率比對(duì)照細(xì)胞更快（圖4c）。已有報(bào)道指出，METTL16位于細(xì)胞質(zhì)促進(jìn)mRNA翻譯，并位于細(xì)胞核將m6A沉積到特定RNA靶標(biāo)29。內(nèi)源METTL16位于GC腫瘤細(xì)胞核中。這些結(jié)果表明，METTL16介導(dǎo)的甲基化導(dǎo)致FDX1 mRNA穩(wěn)定。對(duì)FDX1富集m6A峰的IGV分析顯示，與對(duì)照細(xì)胞（紅色峰）相比，METTL16-siRNA細(xì)胞（綠色峰）中FDX1的m6A水平降低，表明METTL16可能促進(jìn)FDX1的CDS或3'UTR區(qū)域的m6A修飾（圖4d）。因此，選取部分CDS區(qū)域（選擇區(qū)域：110456920-110457047和110462353-110462468）以及3'UTR區(qū)域（選擇區(qū)域：110462469-110464884）的FDX1與pGL3熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建FDX1-WT熒光素酶報(bào)告基因。共轉(zhuǎn)染FDX1熒光素酶報(bào)告基因和不同劑量的METTL16-OE質(zhì)粒后，發(fā)現(xiàn)METTL16顯著促進(jìn)了FDX1-熒光素酶活性（圖4e）。

圖4 METTL16通過(guò)在FDX1 mRNA上進(jìn)行m6A修飾促進(jìn)FDX1蛋白的積累。

          為進(jìn)一步探索，作者使用基于序列的m6A修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)器SRAMP，在FDX1 mRNA上預(yù)測(cè)了可能的m6A修飾位點(diǎn)。結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果和圖4e中的數(shù)據(jù)，作者確定了兩個(gè)潛在的m6A修飾位點(diǎn)，具有非常高的置信度：FDX1轉(zhuǎn)錄本的CDS區(qū)域中的602?A位點(diǎn)和UTR區(qū)域中的820?A位點(diǎn)（圖4f，g）。隨后進(jìn)行了MeRIP-qPCR分析，使用特定引物證明FDX1轉(zhuǎn)錄本上的602位點(diǎn)是METTL16介導(dǎo)的甲基化的直接底物（圖4h）。此外，作者設(shè)計(jì)并構(gòu)建了FDX1-602-Mut和FDX1-820-Mut熒光素報(bào)告基因，通過(guò)將m6A基序中的特定腺嘌呤（A）替換為胸腺嘧啶（T），基于FDX1-WT熒光素報(bào)告基因（圖4g）。雙熒光素檢測(cè)結(jié)果表明，METTL16無(wú)法促進(jìn)攜帶602位點(diǎn)突變的FDX1-CDS/UTR熒光素報(bào)告基因的熒光素活性（圖4i）。在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)METTL16和FDX1的表達(dá)進(jìn)行分析顯示，它們?cè)?span>GC中呈正相關(guān)（圖4j）。另外，免疫組化染色表明，在包含54對(duì)GC和相鄰正常組織的組織微陣列中，METTL16的表達(dá)與FDX1的表達(dá)呈正相關(guān)（圖4k）。這些結(jié)果證實(shí)了METTL16介導(dǎo)的對(duì)FDX1 mRNA的m6A修飾對(duì)FDX1 mRNA的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

5.  METTL16在銅脅迫下發(fā)生K229位點(diǎn)的乳酸化

          接下來(lái)，作者評(píng)估了METTL16在GC中是否對(duì)銅脅迫作出反應(yīng)。在銅處理過(guò)程中，METTL16的mRNA和蛋白水平保持不變，但FDX1的蛋白水平顯著增加（圖5a，b）。為驗(yàn)證在銅脅迫下FDX1表達(dá)的上調(diào)是否依賴(lài)于METTL16，作者測(cè)量了METTL16敲低或敲除細(xì)胞中在有無(wú)銅的情況下FDX1蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，METTL16缺乏阻斷了銅誘導(dǎo)的FDX1上調(diào)（圖5c，d）。由于在銅脅迫下METTL16的mRNA和蛋白水平保持不變，作者隨后使用質(zhì)譜分析測(cè)量了METTL16的PTM變化。分析顯示METTL16蛋白序列上有十一個(gè)乳酸化位點(diǎn)和兩個(gè)乙?；稽c(diǎn)（圖5e）。在乳酸處理后，這六個(gè)乳酸化（紅色）位點(diǎn)的PTM水平顯著增加，暗示這六個(gè)位點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞中可能受到調(diào)節(jié)。作者隨后確認(rèn)了乳酸化或乙?；瘜?duì)銅脅迫的響應(yīng)。結(jié)果顯示，銅處理顯著增加了METTL16的乳酸化水平而非乙?；剑▓D5f）。為了確定METTL16在與銅相關(guān)的代謝中的重要乳酸化位點(diǎn)，作者生成了這六個(gè)乳酸化位點(diǎn)和K410（作為代表性位點(diǎn)，在乳酸脅迫下乳酸化水平未發(fā)生變化）的乳酸化缺陷突變體（K到R）。作者發(fā)現(xiàn)只有METTL16-K229R突變體在銅脅迫下顯示減少的乳酸化（圖5g）。隨后，通過(guò)LC-MS/MS分析展示了METTL16-K229及其他乳酸化位點(diǎn)的b-y離子匹配圖（圖5e，圖5h）。為進(jìn)一步確認(rèn)在銅脅迫下METTL16-K229的乳酸化，作者生成了METTL16 lacty-K229抗體，并使用lacty-K229肽和表達(dá)METTL16-WT、-K229R或-K229E的細(xì)胞驗(yàn)證了其效力和特異性（圖5i，j）。銅和乳酸處理均誘導(dǎo)了METTL16在K229處的強(qiáng)烈乳酸化（圖5k，l），表明K229是銅相關(guān)代謝中的一個(gè)重要乳酸化位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，在銅脅迫下METTL16在K229位點(diǎn)發(fā)生乳酸化。

圖5 在銅脅迫下，METTL16在K229位點(diǎn)發(fā)生乳酸化。

          然后，作者分析了K229乳酸化對(duì)METTL16的潛在影響。首先，METTL16-K229乳酸化不影響METTL16的核定位。METTL16與MAT2A RNA發(fā)夾復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（PDB 6DU5）顯示，K229與E226形成了鹽橋，而自我抑制環(huán)路中的K163（粉色）插入了METTL16的SAM結(jié)合位點(diǎn)。作者的結(jié)構(gòu)建模表明，R230可以通過(guò)與環(huán)路的K163或Q162形成氫鍵來(lái)穩(wěn)定自我抑制狀態(tài)。K229的乳酸化將廢除其與E226的鹽橋，這可能導(dǎo)致E226側(cè)鏈的構(gòu)象變化，并允許與R230形成鹽橋。這將削弱自我抑制狀態(tài)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致METTL16的酶活性升高。接著，作者選擇了METTL16的下游靶標(biāo)，如BCAT1、BCAT2和GPX451來(lái)驗(yàn)證METTL16-K229乳酸化對(duì)其甲基轉(zhuǎn)移酶活性的影響。結(jié)果顯示，METTL16-K229E促進(jìn)了甲基轉(zhuǎn)移酶活性。在穩(wěn)定的METTL16-恢復(fù)細(xì)胞系中進(jìn)一步確保FDX1蛋白水平，其中內(nèi)源性METTL16被野生型（WT）、乳酸化缺陷型（K229R）或乳酸化模擬型（K229E）所替代。結(jié)果顯示，在METTL16敲除細(xì)胞中FDX1蛋白水平下降，在METTL16-WT或-K229E恢復(fù)細(xì)胞中恢復(fù)，但在METTL16-K229R恢復(fù)細(xì)胞中沒(méi)有恢復(fù)（圖5m）。綜上所述，METTL16-K229乳酸化是由銅脅迫誘導(dǎo)的，并促進(jìn)了METTL16的甲基轉(zhuǎn)移酶活性。

6.  SIRT2去乳酸化METTL16-K229并抑制METTL16的活性

          以上數(shù)據(jù)證實(shí)了銅激活了METTL16-K229的乳酸化，但腫瘤細(xì)胞中涉及的特定去乳酸化酶和乳酸化酶仍不清楚。從理論上講，乳酸含量越高，可用的乳酸酸就越多，增加蛋白質(zhì)的乳酸化。因此，作者使用乳酸含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了銅處理的GC細(xì)胞內(nèi)乳酸含量，并發(fā)現(xiàn)銅處理后沒(méi)有顯著差異。然后，作者調(diào)查銅是否介導(dǎo)了對(duì)METTL16的乳酸轉(zhuǎn)移酶或去乳酸酶的調(diào)節(jié)。進(jìn)行LC-MS/MS分析以確定METTL16的結(jié)合蛋白。作為METTL16的結(jié)合蛋白，SIRT2是經(jīng)典的去乙酰化酶，被分類(lèi)為主要的去乳酸酶和乳酸轉(zhuǎn)移酶組（圖6a）。EIF3b也被確定為METTL16的結(jié)合蛋白，與先前的研究結(jié)果一致。為了調(diào)查和驗(yàn)證METTL16與SIRT2之間的相互作用，作者在HGC-27細(xì)胞中檢測(cè)了METTL16-SIRT2的結(jié)合（圖6b）。直接METTL16-SIRT2的結(jié)合通過(guò)His-pull-down實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。METTL16-K229乳酸化受SIRT2過(guò)表達(dá)明顯抑制，受SIRT2沉默或SIRT2抑制劑AGK2處理促進(jìn)。此外，銅誘導(dǎo)的METTL16-K229的乳酸化被SIRT2過(guò)表達(dá)抑制，而被SIRT2沉默或AGK2處理增加?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，SIRT2與METTL16在K229位點(diǎn)相互作用并對(duì)其進(jìn)行去乳酸化。

圖6 SIRT2去乙?；?span>METTL16-K229并抑制METTL16的活性。

          作者進(jìn)一步探討了SIRT2對(duì)穩(wěn)定的METTL16恢復(fù)表達(dá)細(xì)胞系（METTL16-WT、-K229R或-K229E）的調(diào)控作用。SIRT2過(guò)表達(dá)抑制了METTL16-WT細(xì)胞中FDX1的m6A水平，但不影響METTL16-K229R或-K229E細(xì)胞，表明SIRT2通過(guò)METTL16-K229乳?；种屏?span>METTL16的活性（圖6h，i）。此外，SIRT2過(guò)表達(dá)抑制了FDX1蛋白水平（圖6j），而SIRT2沉默和AGK2處理促進(jìn)了FDX1蛋白水平（圖6k）。免疫熒光染色（IF）的結(jié)果表明，在胃癌組織微陣列中，SIRT2蛋白水平與FDX1蛋白水平呈負(fù)相關(guān)（圖6l）。另外，作為去乙酰化酶的SIRT2也可能調(diào)節(jié)了METTL16的去乙?；?。作者發(fā)現(xiàn)，在SIRT2過(guò)表達(dá)后，總的METTL16乙?；兴鶞p少。為了檢驗(yàn)SIRT2介導(dǎo)的METTL16去乙?；欠裼绊?span>METTL16的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，作者產(chǎn)生了具有METTL16-Sh恢復(fù)的METTL16-WT、-K171R、-K171Q、-K348R和-K348Q的細(xì)胞，并進(jìn)行了m6A水平檢測(cè)。結(jié)果顯示，去乙酰化位點(diǎn)對(duì)METTL16的甲基轉(zhuǎn)移酶活性沒(méi)有影響。此外，在METTL16-WT、-K171R、-K171Q、-K348R和-K348Q過(guò)表達(dá)后，FDX1 mRNA水平的增加沒(méi)有顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明，SIRT2介導(dǎo)的METTL16去乙?；⒉挥绊?span>FDX1 mRNA水平。在SIRT2敲除或AGK2處理下，METTL16的表達(dá)與否沒(méi)有顯著差異。綜上所述，這些結(jié)果表明，SIRT2通過(guò)在K229位點(diǎn)進(jìn)行去乳?；瘉?lái)負(fù)向調(diào)節(jié)METTL16的活性。

          為了進(jìn)一步探討銅離子對(duì)SIRT2對(duì)METTL16的調(diào)控作用，作者檢測(cè)了銅離子是否影響SIRT2和METTL16的相互作用。令人意外的是，結(jié)果顯示銅處理略微減少了SIRT2和METTL16的結(jié)合。考慮到在銅離子處理下METTL16的乳?；黾?，作者有理由推測(cè)銅離子處理可能增強(qiáng)了METTL16和乳?；D(zhuǎn)移酶的結(jié)合。

7.  SIRT2-METTL16-FDX1-銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡軸支持一種有前景的治療策略

          FDX1是銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要介體，這是一種治療癌癥的潛在方法。作者發(fā)現(xiàn)，在SIRT2抑制或銅誘導(dǎo)的METTL16-K229乳酰化后，FDX1蛋白水平增加。接下來(lái)，作者檢查了METTL16-K229乳酰化對(duì)銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，在銅應(yīng)激條件下，METTL16敲除導(dǎo)致的DLAT硫辛酰化水平在METTL16-WT/-K229E細(xì)胞中得到了恢復(fù)，但在METTL16-K229R細(xì)胞中未能實(shí)現(xiàn)（圖7a）。此外，在銅離子和elesclomol處理?xiàng)l件下，METTL16-WT或-K229E細(xì)胞誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，但METTL16-K229R細(xì)胞未見(jiàn)此效應(yīng)（圖7b）。此外，SIRT2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了METTL16-WT在銅應(yīng)激條件下所誘導(dǎo)的DLAT硫辛?；黾?，但不包括METT16-K229E，表明SIRT2通過(guò)去乳?；?span>METTL16-K229抑制了細(xì)胞凋亡（圖7c）。一致地，AGK2處理促進(jìn)了在銅應(yīng)激條件下METTL16-WT細(xì)胞中的DLAT硫辛?；?，但在METTL16-K229R細(xì)胞中未見(jiàn)此效應(yīng)（圖7d）。此外，在elesclomol和銅離子存在的情況下，AGK2處理促進(jìn)了細(xì)胞凋亡（圖7e）。

圖7 SIRT2-METTL16-FDX1-銅凋亡軸支持一種有前景的治療策略。

          作者進(jìn)一步評(píng)估了METTL16的乳酸化是否可以增強(qiáng)接受elesclomol治療的小鼠異種移植腫瘤的治療反應(yīng)。METTL16-WT、-K229R和-K229E細(xì)胞被皮下注射到裸鼠的左右后腿上方。觀(guān)察到在接受elesclomol治療的小鼠中，METTL16-WT和-K229E組的腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，但在METTL16-K229R組中未觀(guān)察到這種情況，表現(xiàn)為腫瘤體積和重量的減少（圖7f–h）。

          腫瘤切片中的FDX1染色顯示，在腫瘤異種移植中，METTL16-WT和-K229E組中的FDX1染色較METTL16-K229R組更高（圖7i）。這些結(jié)果表明，在K229位點(diǎn)的METTL16的乳酸化狀態(tài)在決定銅凋亡中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。此外，在腫瘤異種移植中采用了elesclomol和AGK2的聯(lián)合治療。腫瘤切片的分析顯示，在體內(nèi)AGK2增強(qiáng)了elesclomol的治療效果，表現(xiàn)為腫瘤體積和重量的減少（圖7j–l）。這些結(jié)果表明elesclomol和AGK2的聯(lián)合治療在胃癌中是一種有前景的治療方法，特別適用于惡性腫瘤——粘液腺癌（銅含量較高）。

實(shí)驗(yàn)方法

          細(xì)胞培養(yǎng)；小鼠異種移植腫瘤實(shí)驗(yàn)；RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶反應(yīng)（qRT-PCR）；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)；蛋白質(zhì)印跡；His pull-down 檢測(cè)；點(diǎn)突變構(gòu)建；shRNA/siRNA設(shè)計(jì)和構(gòu)建；銅微孔板測(cè)定；免疫沉淀 （IP）；免疫熒光染色；MeRIP-qPCR酶；甲基化 RNA 免疫沉淀測(cè)序 （MeRIP-seq）；RNA 免疫沉淀 （RIP） 檢測(cè)；RNA穩(wěn)定性測(cè)定；CRISPR/Cas9敲除細(xì)胞系；體外乳?；囼?yàn)；生物信息學(xué)分析

參考文獻(xiàn)

          Sun L, Zhang Y, Yang B, Sun S, Zhang P, Luo Z, Feng T, Cui Z, Zhu T, Li Y, Qiu Z, Fan G, Huang C. Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 2023 Oct 20;14(1):6523.