piRNA在多種心血管疾病中高表達(dá)。然而，它們在缺血/再灌注(I/R)損傷引起的心肌細(xì)胞死亡中的作用，特別是壞死性凋亡，仍然是未知的。在這項研究中，發(fā)現(xiàn)心臟壞死性凋亡相關(guān)的piRNA (HNEAP)通過靶向DNMT1介導(dǎo)的m5C甲基化激活Atf7 mRNA轉(zhuǎn)錄物來調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞壞死性凋亡。缺氧/再氧化(H/R)暴露的心肌細(xì)胞和I/R損傷的小鼠心臟中HNEAP表達(dá)水平顯著升高。缺失HNEAP可抑制小鼠心肌細(xì)胞壞死性凋亡，改善心臟功能。機(jī)制上，HNEAP直接與DNMT1相互作用，減弱Atf7 mRNA轉(zhuǎn)錄物的m5C甲基化，從而增加Atf7的表達(dá)水平。ATF7可進(jìn)一步下調(diào)壞死性凋亡抑制劑Chmp2a的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Chmp2a水平降低，心肌細(xì)胞壞死性凋亡進(jìn)展。研究結(jié)果表明，piRNA介導(dǎo)的m5C甲基化參與心肌細(xì)胞壞死的調(diào)控。因此，HNEAP-DNMT1-ATF7-CHMP2A軸可能是減輕缺血性心臟病壞死性凋亡引起的心臟損傷的潛在靶點。本文于2023年10月發(fā)表于“Advanced Science”（IF=15.1）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）心肌壞死性凋亡相關(guān)piRNA的鑒定和表征

         為了系統(tǒng)地識別和研究參與心肌細(xì)胞壞死性凋亡的piRNA的功能，我們首先進(jìn)行了piRNA微陣列分析(圖1a)。我們隨機(jī)選擇了20個piRNA(10個上調(diào)，10個下調(diào))，這些piRNA在微陣列結(jié)果中與假手術(shù)心臟的表達(dá)存在差異，并通過qRT-PCR驗證了它們的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，4個piRNA顯著上調(diào)，2個下調(diào)(圖1b,c)。我們還檢測了缺氧/再氧化(H/R)處理的心肌細(xì)胞中這些piRNA的水平(補(bǔ)充圖)。其中，H/R損傷心肌細(xì)胞中piRNA DQ691316水平顯著升高。接下來，我們檢查了DQ691316在各種組織中的水平，發(fā)現(xiàn)它在心臟中更豐富(圖1d)。與心臟成纖維細(xì)胞相比，DQ691316主要在心肌細(xì)胞中表達(dá)(補(bǔ)充圖)。基于這些結(jié)果，我們假設(shè)DQ691316可能在再灌注性心臟損傷中具有潛在的調(diào)節(jié)功能，并選擇DQ691316進(jìn)行進(jìn)一步研究。我們將這種未知的piRNA命名為心臟壞死相關(guān)piRNA (HNEAP)，并發(fā)現(xiàn)HNEAP在3 '端由2’-O-甲基化組成(圖1e)。隨后，我們觀察到HNEAP分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中(圖1f, g)。

2）抑制HNEAP可阻斷H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死性凋亡

         采用H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型，評價HNEAP在心肌細(xì)胞壞死性凋亡中的作用。HNEAP的強(qiáng)制表達(dá)(圖2a)導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死性凋亡，表現(xiàn)為PI陽性心肌細(xì)胞數(shù)量增加(圖2b, c)，LDH活性增加(圖2d)。相反，使用抑制劑敲低HNEAP(圖2e, f)可減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死性凋亡(圖2g-i)。綜上所述，這些結(jié)果表明HNEAP參與心肌細(xì)胞壞死性凋亡的調(diào)節(jié)。

3）敲除HNEAP可減輕I/R損傷下的心臟損傷和壞死性凋亡

         為了研究HNEAP是否與心肌損傷有功能相關(guān)性，我們使用CRISPR技術(shù)生成了HNEAP基因敲除(HNEAP-KO)小鼠(圖3a)?；蚍中?span>(圖3b)和qRT-PCR分析(圖3c)證實KO小鼠中HNEAP缺失。為了全面了解HNEAP在I/R損傷中的作用，我們對小鼠心臟進(jìn)行缺血1小時，再灌注3小時。在I/R損傷期間，HNEAP-KO小鼠心臟的心肌細(xì)胞壞死性凋亡明顯減少(圖3d, e)，與I/R損傷的WT小鼠相比，HNEAP-KO小鼠的心室功能得到改善(圖3f)，梗死面積減少(圖3g, h)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明HNEAP缺乏可減輕心肌細(xì)胞壞死性凋亡，減輕I/R損傷引起的心功能障礙。

4）HNEAP結(jié)合DNMT1并調(diào)控其m5C甲基化活性

         我們探討了HNEAP調(diào)控心肌細(xì)胞壞死性凋亡的分子機(jī)制。我們使用生物素化的HNEAP進(jìn)行了RNA下拉實驗，并檢測了心肌細(xì)胞中與HNEAP相互作用的表觀遺傳相關(guān)分子。采用LC-MS/MS對HNEAP結(jié)合蛋白進(jìn)行鑒定。在這些蛋白中，我們選擇了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNMT1)(圖4a)。使用生物素化的HNEAP進(jìn)行體外RNA拉下實驗，隨后進(jìn)行免疫印跡，證實HNEAP與DNMT1結(jié)合(圖4b)。RIP后，我們進(jìn)行qPCR，觀察到HNEAP在DNMT1組中富集(圖4c)，表明HNEAP和DNMT1在體內(nèi)相互作用。這些結(jié)果表明HNEAP與DNMT1相互作用，參與m5C甲基化的調(diào)控。為了研究HNEAP調(diào)控m5C修飾的機(jī)制，我們在HNEAP-KO和WT小鼠心臟中進(jìn)行了m5C甲基化RNA免疫沉淀測序(meRIP-seq)。在所有檢測到的m5C mRNA轉(zhuǎn)錄本中(圖4d)，超過一半包含一個m5C峰(圖4e)。在WT和HNEAP-KO小鼠中，m5C峰主要出現(xiàn)在起始和停止密碼子附近的編碼序列(CDSs)中(圖4f)。接下來，我們對HNEAP KO和WT小鼠心臟進(jìn)行RNA-seq分析，探索m5C修飾與基因表達(dá)的關(guān)系(圖4g)，并將m5C峰值數(shù)據(jù)與基因表達(dá)的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，將基因表達(dá)水平與m5C修飾水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)(圖4h)。

5）HNEAP抑制DNMT1介導(dǎo)的m5C修飾，促進(jìn)Atf7 mRNA表達(dá)

         接下來，我們分別對差異甲基化和差異表達(dá)基因進(jìn)行MeRIP-qPCR和qPCR。其中，HNEAP-KO心臟中Atf7的m5C修飾水平顯著升高，其表達(dá)水平顯著降低(圖5a-d)。相反，在HNEAP過表達(dá)的心肌細(xì)胞中，Atf7處的m5C富集減少(圖5e)，同時Atf7 mRNA和蛋白水平顯著增加(圖5f, g)?；谶@些數(shù)據(jù)，我們選擇Atf7作為m5C調(diào)控心肌細(xì)胞壞死性凋亡的候選靶點。接下來，我們研究了HNEAP上調(diào)Atf7表達(dá)的機(jī)制。在HNEAP-KO小鼠心臟中，與WT小鼠心臟相比，DNMT1與Atf7 mRNA的結(jié)合明顯增加(圖5h)。此外，心肌細(xì)胞中DNMT1的強(qiáng)制表達(dá)增加了Atf7 mRNA的m5C修飾水平，降低了Atf7 mRNA和蛋白水平，當(dāng)HNEAP過表達(dá)時，這種作用被抑制(圖5i-k)。綜上所述，這些觀察結(jié)果表明HNEAP通過DNMT1介導(dǎo)Atf7 mRNA的m5C修飾，這種甲基化修飾影響Atf7 mRNA的表達(dá)。

6）敲低Atf7可減輕心肌細(xì)胞壞死性凋亡

         為了證實ATF7在心肌細(xì)胞壞死性凋亡中的調(diào)控作用，我們敲低了心肌細(xì)胞中的ATF7。Atf7敲低可阻斷H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死性凋亡(圖6a-d)。在體內(nèi)，I/R手術(shù)后Atf7 mRNA和蛋白水平顯著升高(圖6e)。Atf7敲除(圖6e)減少心肌細(xì)胞壞死性凋亡(圖6f, g)，改善心室功能(圖6h)，縮小梗死面積(圖6i, j)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明Atf7在心肌細(xì)胞壞死性凋亡的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。

7）Atf7調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞壞死性凋亡中CHMP2A的表達(dá)

         為了研究Atf7的下游效應(yīng)，我們評估了與壞死性凋亡相關(guān)的關(guān)鍵因子的表達(dá)水平。具體而言，心肌細(xì)胞中Atf7沉默后，關(guān)鍵壞死性凋亡分子CHMP2A的表達(dá)水平升高(圖7a,b)。相反，Atf7過表達(dá)降低了Chmp2a的mRNA和蛋白水平(圖7c)，表明Atf7與Chmp2a呈負(fù)相關(guān)。接下來，我們評估Atf7是否直接靶向Chmp2a。我們構(gòu)建了一個含有Atf7結(jié)合位點的Chmp2a啟動子(圖7d)，并使用熒光素酶報告基因試驗測試了Atf7對其活性的影響。Atf7敲除增加了Chmp2a結(jié)構(gòu)體的熒光素酶活性(圖7e)。H/R誘導(dǎo)的Chmp2a轉(zhuǎn)錄減少在心肌細(xì)胞中Atf7敲除后減弱(圖7f)。這些結(jié)果表明Atf7通過直接結(jié)合其CHMP2A的啟動子區(qū)域抑制CHMP2A的表達(dá)。此外，我們研究了HNEAP是否通過靶向CHMP2A調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞壞死性凋亡。結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，HNEAP-KO小鼠心臟中Chmp2a mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高(圖7g)。HNEAP降低心肌細(xì)胞Chmp2a表達(dá)水平，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死性凋亡，而這些作用可通過敲除Atf7而逆轉(zhuǎn)(圖7h-j)。這些數(shù)據(jù)表明Atf7和CHMP2A是HNEAP調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞壞死性凋亡的直接下游分子。

結(jié)論：

         我們的研究表明，HNEAP介導(dǎo)的RNA m5C修飾顯著有助于心肌細(xì)胞壞死性凋亡和心肌損傷。HNEAP可能是減輕I/R損傷后梗死面積和改善心功能的潛在靶點。

實驗方法：

         心肌缺血再灌注(I/R)損傷模型構(gòu)建，Evans藍(lán)色染料測定法，PI染色，LDH活性測定，TUNEL，RNA pull down，m5C-IP-qPCR，FISH，Western Blot，qRT-PCR。

參考文獻(xiàn)：

         Wang K, Li FH, Zhou LY, Zhao XM, Gao XQ, Liu CY, Li XM, Chen XZ, Zhao Y, Cheng XL, Wang RQ, Li RF, Zhang YH, Gao F, Tian JW, Wang K. HNEAP Regulates Necroptosis of Cardiomyocytes by Suppressing the m5 C Methylation of Atf7 mRNA. Adv Sci (Weinh). 2023 Dec;10(34):e2304329. doi: 10.1002/advs.202304329.