賴氨酸巴豆?；?Kcr)在結(jié)直腸癌(CRC)組織中上調(diào)，但其具體作用尚不確定。本研究旨在闡明組蛋白H3 Lys27的巴豆?；?H3K27cr)在促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及機制。在臨床上，H3K27cr在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與晚期臨床分期呈正相關(guān)。在功能上，敲低LINC00922抑制CRC細(xì)胞在體內(nèi)和體外的遷移。此外，補充NaCr通過恢復(fù)H3K27cr水平，恢復(fù)了LINC00922穩(wěn)定敲低細(xì)胞的遷移和侵襲水平。在機制上，LINC00922通過H3K27cr介導(dǎo)的細(xì)胞粘附分子(CAMs)促進侵襲和遷移。值得注意的是，LINC00922與SIRT3相互作用，阻斷其與ETS1啟動子區(qū)域的結(jié)合，導(dǎo)致該啟動子區(qū)域的H3K27cr水平升高，隨后激活ETS1轉(zhuǎn)錄。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了由LINC00922調(diào)控的H3K27cr在促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的一種新的調(diào)節(jié)功能。這一發(fā)現(xiàn)有助于更深入地理解組蛋白巴豆?；诮Y(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程中的作用。本文于2023年10月發(fā)表于Molecular Cancer （IF=37.3）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）H3K27cr水平與結(jié)直腸癌組織轉(zhuǎn)移有關(guān)

       我們利用免疫組織化學(xué)染色法對45例患者的結(jié)直腸腫瘤樣本和14例患者的鄰近組織中的H3K27cr水平進行了研究。有趣的是，研究結(jié)果顯示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位的H3K27cr水平顯著升高(圖1A-B)。與癌旁組織相比，腫瘤組織的H3K27cr水平明顯更高(圖1C)。此外，H3K27cr水平在III期和IV期組織中高于I期和II期組織(圖1D)。鑒于H3K27cr水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在關(guān)聯(lián)，我們提出H3K27cr可能促進腫瘤轉(zhuǎn)移的假設(shè)。NaCr通過直接產(chǎn)生crotonyl-CoA提高組蛋白巴豆?；?。為了驗證我們的假設(shè)，我們將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)在添加10 mM NaCr的培養(yǎng)基中，以提高細(xì)胞內(nèi)H3K27cr的水平(圖1E)。結(jié)果表明，NaCr促進了CRC細(xì)胞的侵襲和遷移(圖1F-1G)。這些發(fā)現(xiàn)提示H3K27cr促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。

2）LINC00922與H3K27cr水平、結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)

       由于先前的研究表明lncRNA在調(diào)節(jié)組蛋白巴豆?；邪l(fā)揮重要作用，因此接下來研究H3K27cr和lncRNA之間的關(guān)系。首先，對TCGA隊列中在正常和CRC組織中表現(xiàn)出差異表達(dá)的lncRNA進行了分析，揭示了CRC組織中多種lncRNA的失調(diào)。隨后，利用H3K27cr抗體對HCT116細(xì)胞進行ChIP-seq檢測，提取啟動子被H3K27cr占據(jù)的基因。隨后，GSEA將這些基因與上述失調(diào)的lncRNA進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因在高表達(dá)LINC00922或其他8種lncRNA的結(jié)直腸癌組織中富集(圖2A)。相反，LINC00922與啟動子標(biāo)記為H3K9cr或H3K18cr的基因之間沒有顯著關(guān)系。值得注意的是，過表達(dá)LINC00922顯著提高了H3K27cr的水平(圖2B)。這些結(jié)果表明LINC00922與H3K27cr之間存在相關(guān)性。隨后，對TCGA隊列CRC患者中LINC00922的臨床意義進行了調(diào)查。結(jié)果顯示，LINC00922的高表達(dá)與CRC患者較短的生存期相關(guān)(圖2C)。接下來，我們檢查了TCGA隊列中LINC00922與CRC組織臨床病理特征之間的相關(guān)性。Mann-Whitney U分析顯示，與正常組織相比，CRC組織中LINC00922的表達(dá)顯著升高(圖2D)。此外，LINC00922在有遠(yuǎn)處或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)高于無遠(yuǎn)處或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者(圖2E-2F)。GEO隊列的薈萃分析顯示，高表達(dá)的LINC00922增加了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(圖2G)。綜上所述，高表達(dá)的LINC00922增加了CRC轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，并與CRC患者預(yù)后不良相關(guān)。

3）LINC00922加速結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移

       為了進一步探討LINC00922與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，我們研究了LINC00922在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用。結(jié)果顯示，LINC00922的缺失降低了CRC細(xì)胞的侵襲和遷移水平，而LINC00922的過表達(dá)則顯示出相反的效果(圖3A-3B)。我們還研究了LINC00922是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移。將穩(wěn)定的LINC00922敲低細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，敲除LINC00922可顯著減少肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(圖3C，3D)。免疫印跡分析表明，當(dāng)LINC00922在CRC細(xì)胞中被敲除時，EMT相關(guān)基因(如Vimentin和Snail1)的表達(dá)水平顯著下調(diào)。相反，過表達(dá)LINC00922具有相反的效果(圖3E-3G)，增加了這些基因的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，LINC00922促進CRC細(xì)胞的侵襲和遷移。

4）LINC00922通過H3K27cr介導(dǎo)的CAMs促進侵襲和遷移

       為了研究LINC00922是否通過H3K27cr調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移，將LINC00922穩(wěn)定敲低的細(xì)胞用10 mM NaCr處理48 h，恢復(fù)H3K27cr水平。結(jié)果顯示，補充NaCr恢復(fù)了E-cad、Vimentin和Snail1的水平，以及穩(wěn)定的LINC00922敲低細(xì)胞的侵襲和遷移(圖4A-4B)，表明LINC00922通過H3K27cr調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞的侵襲和遷移。隨后，使用H3K27cr抗體對過表達(dá)LINC00922的HCT116細(xì)胞進行ChIP-seq檢測。在LINC00922過表達(dá)細(xì)胞和對照細(xì)胞之間，共有21253個峰表現(xiàn)出差異占用(圖4C)，表明LINC00922影響了H3K27cr在染色體上的占用。KEGG分析上述21253個峰注釋的基因的生物學(xué)途徑，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移途徑豐富，包括局灶黏附和粘附體連接(圖4D)。由于先前的研究表明組蛋白巴豆酰化強有力地表明激活啟動子，我們隨后在啟動子區(qū)域提取了653個具有兩個峰的基因進行進一步研究。為了鑒定LINC00922通過H3K27cr調(diào)控的特定細(xì)胞類型，我們使用GSEA分析了這653個基因在結(jié)直腸癌組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中的富集情況。該分析涉及來自GSE196964數(shù)據(jù)集的5678個細(xì)胞，鑒定出12個主要的細(xì)胞亞型(圖4E)。在結(jié)腸組織中，653基因在樹突狀細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、祖細(xì)胞和上皮細(xì)胞中富集。在結(jié)直腸癌組織中，除了樹突狀細(xì)胞和轉(zhuǎn)運擴增細(xì)胞外，653基因在所有細(xì)胞類型中都富集(圖4F)。對其他數(shù)據(jù)集進行了相同的分析。對來自GSE221575數(shù)據(jù)集的5179個細(xì)胞進行了分析，鑒定出11種主要的細(xì)胞亞型(補充結(jié)果未展示)。在結(jié)腸組織中，653基因在內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中富集。在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移(LM)結(jié)直腸癌組織中，觀察到主要富集在B細(xì)胞和上皮細(xì)胞中。因此，上皮細(xì)胞是下一個重點。

       為了研究LINC00922通過H3K27cr影響的調(diào)控途徑，我們注釋了與這653個基因相關(guān)的生物學(xué)途徑。我們的研究結(jié)果顯示79個通路，如局灶粘附、粘附連接、緊密連接和細(xì)胞粘附分子(CAMs)，包含超過5個基因。在包含CRC和LM組織的GSE225857數(shù)據(jù)集中，對20,753個細(xì)胞進行了全面分析，鑒定出12種主要細(xì)胞亞型(圖4G)。將79種途徑分別與從CRC和LM組織中提取的上皮細(xì)胞進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAMs通路在LM組織來源的上皮細(xì)胞中呈負(fù)富集(圖4H)。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，LINC00922通過H3K27cr介導(dǎo)的CAMs促進侵襲和遷移。

5）LINC00922通過ETS1促進侵襲和遷移

       前期研究表明，ETS1調(diào)控CAMs的表達(dá)。因此，我們下一步研究LINC00922是否通過ETS1調(diào)控入侵和遷移。首先，本研究證明外源性ETS1促進了CRC細(xì)胞的侵襲、遷移和細(xì)胞運動(圖5A-5B)。此外，過表達(dá)ETS1增加了Vimentin和Snail1的表達(dá)，降低了E-cad的表達(dá)(圖5C)。拯救實驗表明，抑制ETS1通過恢復(fù)Vimentin和Snail1水平，恢復(fù)CRC細(xì)胞的侵襲、遷移和細(xì)胞運動水平(圖5D-5F)。這些結(jié)果表明，LINC00922通過ETS1調(diào)控了侵襲和遷移。

6）LINC00922通過調(diào)節(jié)H3K27cr水平調(diào)控ETS1的表達(dá)

       接下來，我們研究了LINC00922是否改變了ETS1的表達(dá)。我們對28例CRC患者的組織進行了qRT-PCR分析。結(jié)果顯示，LINC00922的表達(dá)與ETS1之間存在直接相關(guān)性(圖6A)。敲低LINC00922的表達(dá)表明，瞬時和穩(wěn)定敲低LINC00922均可降低ETS1 mRNA水平(圖6B-6C)。相反，CRC細(xì)胞中LINC00922的過表達(dá)增加了ETS1的mRNA水平(圖6D)。ETS1的蛋白水平也表現(xiàn)出類似的趨勢(圖6E-6G)。熒光圖像還顯示，穩(wěn)定的LINC00922敲低顯著降低了ETS1的蛋白水平(圖6H)。接下來，我們研究LINC00922是否通過H3K27cr調(diào)控ETS1的表達(dá)。首先，10 mM NaCr處理的HCT116細(xì)胞增加了H3K27cr和ETS1的水平，表明H3K27cr可能激活了ETS1的轉(zhuǎn)錄(圖6I)。隨后，在穩(wěn)定的LINC00922敲低細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入10 mM NaCr，培養(yǎng)48 h后恢復(fù)H3K27cr水平。我們發(fā)現(xiàn)，NaCr恢復(fù)了LINC00922穩(wěn)定敲低細(xì)胞的ETS1表達(dá)，表明LINC00922通過調(diào)節(jié)H3K27cr調(diào)節(jié)ETS1表達(dá)(圖6J-6K)。ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示，過表達(dá)的LINC00922增加了H3K27cr在ETS1啟動子區(qū)域的占據(jù)(圖6L)。ChIP-qPCR也證實了這一結(jié)果，即沉默LINC00922顯著降低了H3K27cr在ETS1啟動子區(qū)域的占據(jù)，而外源LINC00922則起到相反的作用(圖6M)。綜上所述，LINC00922改變了H3K27cr在ETS1啟動子區(qū)域的富集水平。導(dǎo)致ETS1表達(dá)的改變。

7) LINC00922通過與SIRT3相互作用改變H3K27cr的占用

       我們研究了LINC00922如何改變ETS1啟動子上H3K27cr的富集水平。HCT116細(xì)胞的ChIP-seq顯示SIRT3分布在TSS區(qū)附近(圖7A)。然而，SIRT3如何向TSS區(qū)富集的過程尚不清楚。我們假設(shè)LINC00922參與了SIRT3向TSS區(qū)域的富集。為了驗證這一點，我們首先研究了HCT116細(xì)胞中SIRT3和H3K27cr之間的相關(guān)性。免疫熒光圖像顯示，SIRT3和H3K27cr在HCT116細(xì)胞的細(xì)胞核中共定位(圖7B)。不出所料，外源性SIRT3降低了H3K27cr水平(圖7C)。接下來，我們研究了LINC00922是否通過調(diào)節(jié)SIRT3改變了H3K27cr的表達(dá)。RNA免疫沉淀(RIP)實驗顯示，在HCT116細(xì)胞中，LINC00922與SIRT3相互作用，且在過表達(dá)SIRT3的HCT116細(xì)胞中富集程度更高(圖7D)。熒光原位雜交(RNA-FISH)實驗顯示，LINC00922與SIRT3在HCT116細(xì)胞中共定位(圖7E)。RIP實驗還顯示，LINC00922與H3K27cr相互作用(圖7F)。隨后，我們利用ChIP-qPCR研究了LINC00922是否影響了ETS1啟動子區(qū)域SIRT3的富集。結(jié)果顯示，在LINC00922敲低的細(xì)胞中，ETS1啟動子區(qū)域SIRT3的富集程度更高，而外源LINC00922則表現(xiàn)出相反的效果(圖7G)。隨后，我們進行了拯救實驗。值得注意的是，SIRT3過表達(dá)恢復(fù)了ETS1的表達(dá)(圖7H)。我們的研究結(jié)果表明，LINC00922與SIRT3相互作用并將其逐出ETS1啟動子區(qū)域，從而增加了ETS1啟動子區(qū)域的H3K27cr水平，激活了ETS1表達(dá)。

結(jié)論

       我們的研究提出了LINC00922介導(dǎo)的SIRT3募集和H3K27cr修飾在人類癌癥轉(zhuǎn)移中的工作模型。更好地了解組蛋白巴豆?；谏镞^程中的關(guān)鍵作用可能會導(dǎo)致新的癌癥治療策略。

實驗方法

單細(xì)胞RNA測序，transwell，傷口愈合實驗，WB，qRTPCR，免疫熒光，ChIP-qPCR，RNA免疫沉淀實驗，F(xiàn)ISH，IHC。

參考文獻

Liao M, Sun X, Zheng W, Wu M, Wang Y, Yao J, Ma Y, Gao S, Pei D. LINC00922 decoys SIRT3 to facilitate the metastasis of colorectal cancer through up-regulation the H3K27 crotonylation of ETS1 promoter. Mol Cancer. 2023 Oct 4;22(1):163. doi: 10.1186/s12943-023-01859-y.