實驗方法：外泌體分離，PMEVCs分離，transwell，劃痕試驗，管形成試驗，ROS和抗氧化活性的檢測，small RNA測序，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，動物實驗，WB，ELISA，肺損傷測量，HE，免疫熒光，流式。

膿毒癥是一種發(fā)病率和死亡率高的致命疾病，急性肺損傷是其最早和最嚴重的并發(fā)癥。過度炎癥引起的肺微血管內(nèi)皮細胞（PMVECs）損傷在膿毒癥急性肺損傷中起重要作用。本研究旨在探討脂肪來源干細胞（ADSCs）外泌體對過度炎癥性PMVECs損傷的保護作用及其機制。我們成功分離出ADSCs外泌體，并證實了其特征。ADSCs外泌體減少了PMVECs中過度炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的ROS積累和細胞損傷。此外，ADSCs外泌體抑制過度炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的鐵死亡，上調(diào)GPX4在PMVECs中的表達。進一步的GPX4抑制實驗表明，ADSCs外泌體通過上調(diào)GPX4來緩解炎癥反應(yīng)引起的鐵死亡。同時，ADSCs外泌體可增加Nrf2的表達和核易位，降低Keap1的表達。miRNA分析和進一步的抑制實驗證實，ADSCs外泌體特異性遞送miR-125b-5p可抑制Keap1，緩解鐵死亡。在CLP誘導(dǎo)的膿毒癥模型中，ADSCs外泌體可減輕肺組織損傷，降低死亡率。此外，ADSCs外泌體可減輕肺組織氧化應(yīng)激損傷和鐵死亡，顯著提高Nrf2和GPX4的表達。綜上所述，我們揭示了一種新的潛在治療機制，即ADSCs外泌體中的miR-125b-5p可以通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/GPX4表達，緩解膿毒癥急性肺損傷中炎癥誘導(dǎo)的PMVECs鐵死亡，從而改善膿毒癥急性肺損傷。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）ADSCs和外泌體的特征

從脂肪組織分離的原代ADSCs倒置顯微鏡下呈紡錘形(圖1A)。如圖1B所示，特異性間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD73和CD90在原代ADSCs中呈陽性表達。這些結(jié)果證實了ADSCs的特征。然后提取外泌體，用TEM、western blot和NTA進行鑒定。透射電鏡下分離得到的囊泡呈杯狀典型外泌體形態(tài)，具有雙層膜結(jié)構(gòu)(圖1C)。Western blot結(jié)果顯示，外泌體分子標(biāo)志物CD63、CD9和TSG101在分離顆粒中高表達(圖1D)。NTA結(jié)果顯示，顆粒直徑為50 ~ 150 nm，平均為117.5 nm(圖1E)。CD31免疫熒光結(jié)果顯示，從肺毛細血管分離的細胞被CD31陽性染色，說明我們成功分離了PMVECs(圖1F)。如圖1G所示，PKH26標(biāo)記的外泌體可被PMVECs吸收。這些結(jié)果都表明我們成功分離了ADSCs外泌體和PMVECs。

圖1

2）ADSCs外泌體改善了炎癥反應(yīng)引起的PMVECs損傷

從新生小鼠肺組織中成功分離出原發(fā)性PMVECs。將LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞的條件培養(yǎng)基(CM)加入PMVECs細胞誘導(dǎo)損傷。同時，在PMVECs中加入ADSCs外泌體以保護其免受巨噬細胞CM誘導(dǎo)的損傷(圖2A)。CCK8結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM處理PMVECs的細胞活力減弱(圖2B)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM處理PMVECs的細胞凋亡率顯著高于未處理的PMVECs(圖2C)。然而，當(dāng)用ADSCs外泌體處理PMVECs時，PMVECs的活力恢復(fù)(圖2B)，凋亡率減少（圖2D）。Caspase3免疫熒光結(jié)果也驗證了巨噬細胞CM對PMVECs凋亡的上調(diào)作用和ADSCs的下調(diào)作用。如圖2D所示，用LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM處理PMVECs時，Ki67的熒光強度降低，而使用ADSCs外泌體時，Ki67的熒光強度升高。在成管實驗中，巨噬細胞CM組的成管數(shù)量低于對照組和ADSCs外泌體組(圖2D)。transwell實驗和劃痕實驗均顯示，巨噬細胞CM削弱了PMVECs的遷移能力，而ADSCs外泌體可以恢復(fù)PMVECs的遷移能力（圖2E，2F）。因此，上述結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM損傷了PMVECs的活力、增殖和遷移，而ADSCs改善了巨噬細胞CM誘導(dǎo)的損傷，減少了細胞凋亡。

圖2

3）ADSCs外泌體減少了PMVECs中炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的ROS積累

為了揭示ADSCs外泌體對巨噬細胞CM刺激的PMVECs的保護作用，我們檢測了不同處理PMVECs的ROS積累、DNA損傷和抗氧化活性。流式細胞術(shù)和免疫熒光結(jié)果顯示，當(dāng)PMVECs暴露于LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM時，ROS的積累顯著增加，而ADSCs外泌體則減緩了ROS的積累(圖3A和3B)。8-OHdG作為DNA損傷的指標(biāo)，免疫熒光結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM可增加PMVECs中8-OHdG的表達，而ADSCs外泌體抵消了巨噬細胞CM的上調(diào)作用。在LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM作用下，PMVECs中SOD含量和CAT活性降低(圖3D)。如圖3D所示，ADSCs外泌體可增加PMVECs中SOD含量和CAT活性。線粒體膜電位(MMP)是線粒體功能狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)，也是細胞凋亡的指標(biāo)之一，可以通過膜電位敏感染料JC-1進行檢測。如圖3E所示，在對照組和ADSCs外泌體組中，大部分線粒體呈紅色熒光，而LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM中熒光以綠色為主。即對照組和ADSCs外泌體組MMP均高于CM組?？傊┞队贚PS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM導(dǎo)致PMVECs中ROS積累和氧化損傷，但ADSCs外泌體減少了PMVECs中炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的ROS積累和損傷。

圖3

4）ADSCs外泌體減少PMVECs炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的鐵死亡

為驗證ADSCs外泌體對PMVECs炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)損傷的調(diào)節(jié)作用機制，進一步檢測鐵死亡相關(guān)指標(biāo)。通過4-羥基壬烯醛(4HNE)修飾和丙二醛(MDA)檢測脂質(zhì)過氧化水平。如圖4A和4B所示，LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM顯著增加了PMVECs的脂質(zhì)過氧化表達，而ADSCs外泌體則降低了其表達。此外，LPS誘導(dǎo)巨噬細胞CM下調(diào)了GSH和FRAP的表達，增加了MDA的表達。但ADSCs外泌體可緩解CM誘導(dǎo)的GSH、FRAP下調(diào)和MDA升高(圖4C)。進一步的免疫熒光結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM增強了4HNE的熒光強度，削弱了GPX4的熒光強度(圖4D)。ADSCs外泌體可以逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM引發(fā)的變化(圖4D)。western blot結(jié)果證實LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM和ADSCs外泌體對4HNE和GPX4表達具有相同的調(diào)節(jié)作用(圖4E)。western blot結(jié)果顯示，CM處理的PMVECs 中HO-1和Nrf2表達略有升高，而ADCSs外泌體組HO-1和Nrf2表達顯著升高(圖4E)。綜上所述，LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM可增加PMVECs 中ROS積累和鐵死亡水平，而ADSCs外泌體可使其恢復(fù)。

圖4

5）ADSCs外泌體通過上調(diào)GPX4緩解PMVECs炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的鐵死亡

上述結(jié)果表明，ADSCs外泌體可以抑制鐵死亡，并增加GPX4。通過GPX4抑制實驗進一步驗證ADSCs外泌體是否通過調(diào)節(jié)GPX4對PMVECs的鐵死亡有抑制作用。如圖5A所示，當(dāng)RSL3抑制GPX4的表達時，即使用ADSCs外泌體處理PMVECs，細胞活力和FRAP含量也會急劇下降。相反，當(dāng)RSL3抑制GPX4的表達時，脂質(zhì)過氧化水平及其產(chǎn)物顯著升高。western blot結(jié)果顯示，RSL3處理PMVECs后，4HNE和HO-1表達顯著增加，GPX4表達明顯抑制。當(dāng)GPX4表達被RSL3抑制時，ADSCs外泌體對炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的鐵死亡的保護作用被取消(圖5B)。也就是說，ADSCs外泌體通過上調(diào)GPX4在PMVECs中緩解炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖5

6）ADSCs外泌體調(diào)節(jié)PMVECs中Nrf2通路的表達

Nrf2和Keap1信號通路是通過調(diào)控下游基因HO-1、GXP4、NQO1等降低氧化應(yīng)激的最關(guān)鍵、最經(jīng)典的細胞防御和生存通路之一。因此，我們檢測了Nrf2通路中重要成分的表達。如圖4E所示，western blot結(jié)果顯示，暴露于LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM時Nrf2表達略有升高，而ADSCs外泌體處理時Nrf2表達顯著升高。此外，ADSCs外泌體可以增加下游抗氧化基因HO-1和GXP4的表達(圖4E)。western blot和PCR結(jié)果也顯示ADSCs外泌體可上調(diào)Nrf2的表達，下調(diào)Nrf2的負調(diào)控因子Keap1的表達(圖6A和6B)。western blot檢測細胞質(zhì)和細胞核中的Nrf2蛋白，結(jié)果顯示ADSCs外泌體可輕微增加細胞質(zhì)Nrf2的表達，而顯著增加細胞核Nrf2的表達(圖6C)。綜上所述，ADSCs外泌體可通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/GPX4軸緩解LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞CM誘導(dǎo)的ROS積累、氧化損傷和鐵死亡。

圖6

7）ADSCs外泌體通過miR-125b-5p的傳遞調(diào)控PMVECs中的Nrf2通路

為了繪制ADSCs外泌體的miRNA表達譜，進行了微陣列分析。如圖7A所示，多達63個miRNAs在ADSCs外泌體中被檢測到。最豐富的前15個miRNAs為miR-24-3p、miR-23a-3p、miR-12136、miR-19b- 3p、let-7b-5p、let-7a-5p、let-7i-5p、miR-126-5p、miR-145-5p、miR-214- 3p、miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-3662和miR-423-5p。為了預(yù)測檢測到的miRNA的潛在靶基因，我們探索了miRDB、miRtarbase、starBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫，并進一步研究了預(yù)測靶基因。值得注意的是，Keap1是miR-125b-5p的預(yù)測潛在靶點。然后，qRT-PCR結(jié)果證實miR-125b-5p在ADSCs外泌體中表達(圖7B)，并且在ADSCs外泌體處理PMVECs后，miR-125b-5p的表達大幅增加(圖7C)。隨后，通過雙熒光素酶報告基因分析驗證miR-125b-5p對Keap1的調(diào)控作用。如圖7D所示，miR-125b-5p的過表達降低了Keap1-3'UTR-wt報告基因的活性。即Keap1是miR-125b-5p的調(diào)控靶點，miR-125b-5p可以與Keap1基因的3'UTR結(jié)合。為了進一步驗證miR-125b-5p對Keap1的調(diào)控作用，我們設(shè)計合成了miR-125b-5p的模擬物和抑制劑，并將其轉(zhuǎn)染到PMVECs中。如圖7E所示，mimic顯著促進miR-125b-5p的表達，而inhibitor則保持不變。mimic上調(diào)miR-125b-5p表達后，Keap1表達被抑制，Nrf2和GPX4表達上調(diào)。同樣，抑制劑增加了Keap1的表達，而降低了Nrf2和GPX4的表達(圖7F)。此外，我們用抑制劑轉(zhuǎn)染ADSCs外泌體，將其加入PMVECs中，并與ADSCs外泌體比較其對Keap1通路的調(diào)控作用。結(jié)果表明，當(dāng)miR-125b-5p在ADSCs外泌體中被抑制劑抑制表達時(圖7G)， Keap1的下調(diào)和Nrf2、GPX4的上調(diào)均得到緩解(圖7H)。即當(dāng)miR-125b-5p在ADSCs外泌體中被抑制表達時，ADSCs外泌體對Keap1/Nrf2/GPX4軸的調(diào)控作用被抵消。總之，ADSCs外泌體對Keap1/Nrf2/GPX4軸的調(diào)節(jié)作用取決于miR-125b-5p的傳遞。

圖7 

8）ADSCs外泌體緩解CLP誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷

為了檢測ADSCs外泌體對膿毒癥急性肺損傷的保護作用，如圖8A所示，我們建立了CLP膿毒癥模型，并用ADSCs外泌體進行治療。結(jié)果顯示，CLP組小鼠24小時死亡一半，48小時死亡80%(圖8B)。當(dāng)使用ADSCs外泌體治療時，24小時死亡率下降到10%，48小時死亡率下降到60%(圖8B)。收集肺組織進行HE染色，并通過肺損傷評分、支氣管肺泡灌洗液(BALF)和濕/干比分析進行損傷評分。CLP組小鼠BALF中蛋白濃度及干濕比均顯著高于假手術(shù)組及ADSCs外泌體組(圖8C)。HE結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CLP組肺泡毛細血管腫脹充血，肺泡腔出血，并伴有炎癥細胞浸潤(圖D)。而ADSCs外泌體明顯改善上述損傷。此外，CLP增加了小鼠肺損傷評分，而ADSCs外泌體降低了肺損傷評分(圖8E)。因此，ADSCs外泌體緩解了CLP誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。

圖8

9）ADSCs外泌體緩解CLP誘導(dǎo)的ROS并增強小鼠的抗氧化能力
為了檢測CLP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和ADSCs外泌體對肺血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激和損傷的影響，檢測了ROS、SOD、FRAP、MDA和GSH。如圖9A所示，結(jié)果顯示CLP處理后ROS水平明顯升高，而ADSCs外泌體可以減少ROS的積累。MDA檢測顯示，膿毒癥小鼠BALF中MDA水平遠高于假手術(shù)組和ADSCs外泌體組(圖9A)。同時，CLP處理后抗氧化劑SOD、FRAP和GSH水平顯著降低，ADSCs外泌體可恢復(fù)其含量。Tunel染色顯示CLP增加小鼠肺組織凋亡，而ADSCs外泌體減輕膿毒癥大鼠肺組織凋亡(圖9B)。OHdG和CD31免疫熒光雙染色顯示CLP組CD31陽性細胞8OHdG表達明顯升高，而ADSCs外泌體組較CLP組表達降低(圖9C)。

圖9

10）ADSCs外泌體通過上調(diào)肺組織GPX4緩解CLP誘導(dǎo)的鐵死亡

為驗證ADSCs外泌體對CLP誘導(dǎo)的急性肺損傷中鐵死亡和GPX4表達的調(diào)節(jié)作用，采用western blot、PCR和免疫熒光染色檢測4HNE和GPX4的表達。如圖10A所示，western blot結(jié)果顯示CLP處理后肺組織中4HNE蛋白表達顯著增加，而ADSCs外泌體處理后4HNE蛋白表達顯著降低。相反，加入CLP后GPX4表達下調(diào)，加入ADSCs外泌體后GPX4表達上調(diào)。有趣的是，CLP和ADSCs外泌體均能增加HO-1的表達，而ADSCs外泌體比CLP更能增加HO-1的表達(圖10A)。4HNE、GPX4和HO-1的免疫組化染色結(jié)果也顯示CLP處理增加了肺組織中4HNE和HO-1陽性細胞，減少了GPX4陽性細胞(圖10B)。ADSCs外泌體減少了4HNE陽性細胞數(shù)量，增加了GPX4和HO-1陽性細胞數(shù)量(圖10B)。PCR結(jié)果與western blot和免疫組化結(jié)果一致(圖10C)。此外，4HNE和GPX4免疫熒光染色結(jié)果也顯示CLP在肺組織中增加了4HNE表達，減少了GPX4表達，而ADSCs外泌體增加GPX4表達，降低4HNE表達(圖10D)。因此，ADSCs外泌體通過上調(diào)肺組織中的GPX4來緩解CLP誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖10 

11）ADSCs外泌體在CLP誘導(dǎo)的急性肺損傷中調(diào)控Keap1/Nrf2的表達

Keap1/Nrf2系統(tǒng)通過調(diào)控GPX4、HO-1等一系列抗氧化基因，是氧化應(yīng)激系統(tǒng)的關(guān)鍵元件。如圖11A所示，在CLP誘導(dǎo)的膿毒癥肺組織中Nrf2蛋白表達略有升高，在ADSCs外泌體處理的小鼠中Nrf2蛋白表達明顯升高。然而，Keap1在CLP誘導(dǎo)的膿毒癥肺組織中表達略有降低，在ADSCs外泌體處理的小鼠中表達顯著降低(圖11A)。PCR結(jié)果也顯示ADSCs外泌體處理的膿毒癥小鼠肺組織中Nrf2 mRNA表達升高(圖11A)。Nrf2和CD31免疫熒光雙染色結(jié)果顯示Nrf2在CD31+細胞中的平均熒光強度高于CD31?細胞，在ADSCs外泌體小鼠肺組織中的熒光強度高于CLP組(圖11B)。此外，Nrf2免疫組化染色結(jié)果也表明，該抗氧化分子在CLP小鼠肺組織中略有上調(diào)，而在ADSCs外泌體作用下則顯著上調(diào)(圖11B)，因此，ADSCs外泌體調(diào)節(jié)了CLP誘導(dǎo)的急性肺損傷中Keap1/Nrf2的表達。

圖11

結(jié)論：我們揭示了一種新的潛在治療機制，即ADSCs外泌體傳遞miR-125b-5p可通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/GPX4表達，緩解膿毒癥急性肺損傷所致的PMVECs鐵死亡，從而改善膿毒癥急性肺損傷。

參考文獻：Shen K, Wang X, Wang Y, Jia Y, Zhang Y, Wang K, Luo L, Cai W, Li J, Li S, Du Y, Zhang L, Zhang H, Chen Y, Xu C, Zhang J, Wang R, Yang X, Wang Y, Hu D. miR-125b-5p in adipose derived stem cells exosome alleviates pulmonary microvascular endothelial cells ferroptosis via Keap1/Nrf2/GPX4 in sepsis lung injury. Redox Biol. 2023 Mar 9;62:102655. doi: 10.1016/j.redox.2023.102655.