肺癌在全球所有癌癥類型中發(fā)病率和死亡率最高，其5年總生存率較差。肺癌根據(jù)其病理特征可分為小細胞肺癌（small cell Lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌兩種亞型。SCLC因其侵襲性強、惡性程度高、易發(fā)生耐藥而導致眾多患者死亡。最初，大多數(shù)SCLC患者對含鉑一線化療有應答。然而，患者的反應往往不持久，容易產生化療耐藥，導致疾病復發(fā)。線粒體自噬是一種選擇性自噬，參與線粒體去極化、缺氧、發(fā)育等多種生物學過程。因此，探索SCLC的耐藥機制對于尋找逆轉耐藥的治療靶點至關重要。既往研究表明，自噬參與了SCLC對化療的耐藥，且自噬在化療耐藥的SCLC細胞株中顯著增強。然而，關于線粒體自噬是否與SCLC耐藥特異性相關的報道較少。該研究發(fā)表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF: 12.658。

技術路線：

主要研究結果：

1. METTL3在SCLC耐藥細胞株中高表達，且與患者不良預后相關

許多研究表明，m6A修飾在胃癌、肝癌等多種實體腫瘤的化療或靶向耐藥中發(fā)揮作用。為了確定m6A是否參與SCLC化療耐藥，作者對敏感和耐藥的SCLC細胞株（H69和H69AR）進行了高通量全轉錄組測序，并分析了m6A相關基因的表達差異。作者觀察到，在化療敏感和化療耐藥細胞系之間，與m6A修飾相關的7個基因的表達有顯著差異（圖1A）。采用單因素Cox回歸分析這7個基因在兩組SCLC患者中的表達情況，并進一步分析m6A相關基因的表達與患者預后的關系。隊列1來自公共數(shù)據(jù)庫GEO（GSE60052），包括79例SCLC患者的轉錄組和臨床數(shù)據(jù)，隊列2包括58例在當?shù)蒯t(yī)院接受治療的SCLC患者。在總生存（OS）的單因素Cox回歸分析中，在兩個隊列中只有METTL3與SCLC生存和預后相關（圖1B-C）。隊列1和隊列2的生存曲線均顯示，METTL3高表達與較差的OS相關，METTL3是不良預后的標志（圖1D）。

為了進一步明確METTL3是否在SCLC化療耐藥中發(fā)揮關鍵作用，作者采用qRT-PCR和Western blot分析了METTL3在兩對化療藥物敏感和耐藥細胞株。METTL3在耐藥細胞株H69AR和H446DDP中的mRNA和蛋白表達水平顯著高于其對化療敏感的細胞株（圖1E-F）。免疫熒光也顯示METTL3在耐藥SCLC細胞株中高表達，主要定位于細胞核，少部分位于細胞質（圖11G）。

圖1METTL3在SCLC中的表達及其臨床意義

2. METTL3過表達促進SCLC化療耐藥

為了進一步評估METTL3是否參與SCLC化療耐藥，作者使用慢病毒轉導構建了穩(wěn)定敲低METTL3的H69AR和H446DDP細胞株。在化療后24小時檢測細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）和細胞凋亡，在耐藥細胞株中敲低METTL3顯著降低了化療藥物CDDP和VP16的IC50（圖2A-B）。流式細胞術結果也顯示，METTL3敲低組的凋亡細胞比例高于對照組，且這種差異具有統(tǒng)計學意義（圖2C-D）。Western blot結果顯示，敲低METTL3后，表明細胞凋亡強度的凋亡蛋白cleaved PARP和BAX的表達水平顯著升高，而抗凋亡蛋白BCL-2的表達水平顯著降低（圖2E）。

為了補充在化療耐藥細胞系中的發(fā)現(xiàn)，作者在化療敏感細胞系H69和H446中過表達METTL3。與空載體對照組相比，過表達METTL3的細胞化療IC50值顯著增加（圖2F-G）。凋亡蛋白的Western blot和流式細胞術分析也表明，METTL3過表達顯著降低了凋亡細胞的比例（圖2H-J）。

為了闡明METTL3誘導SCLC化療耐藥是否依賴于其甲基轉移酶功能，作者構建了METTL3野生型和突變型重組質粒（圖2K）。在SCLC細胞中過表達METTL3顯著增加了化療藥物的IC50，而敲除METTL3甲基轉移酶結構域阻斷了METTL3誘導的化療耐藥（圖2L）。這些數(shù)據(jù)表明，METTL3通過其甲基轉移酶結構域調控SCLC的化療耐藥過程。

圖2METTL3在體外誘導SCLC化療耐藥

3. METTL3在體內促進SCLC化療耐藥

由于鉑類-依托泊苷聯(lián)合方案仍然是SCLC的一線治療選擇，因此作者同時使用CDDP和VP16在體內研究METTL3是否參與SCLC的化療耐藥。裸鼠皮下注射敲低METTL3的H69AR細胞或過表達METTL3的H69細胞，并給予PBS或化療藥物（CDDP 3 mg/kg和VP-16 2 mg/kg）處理。METTL3敲低顯著抑制移植腫瘤的生長（圖3A），并顯著降低化療后移植腫瘤的體積（圖3B-C）。通過IHC評估腫瘤異種移植中的METTL3表達（圖3D）。相比之下，過表達METTL3的H69腫瘤的生長速度和體積顯著高于對照H69腫瘤（圖3E-G）。METTL3在異種移植瘤中的表達也通過IHC進行評估（圖3H）。METTL3在體內可促進SCLC化療耐藥，METTL3有望成為逆轉SCLC化療耐藥的有效治療靶點。

圖3METTL3在體內對SCLC化療耐藥性的影響

4. METTL3促進DCP2的m6A甲基化，調控DCP2的表達

為了進一步闡明METTL3的靶基因以及METTL3促進SCLC化療耐藥的機制，作者對METTL3敲低和對照H69AR細胞進行了MeRIP-seq，敲低和對照細胞的m6A位點均高度富集了GGAC基序（圖4A）。由于METTL3是一種m6A甲基轉移酶，作者聚焦于敲低METTL3后m6A甲基化水平顯著降低的基因，并通過倍數(shù)差異選擇前20個基因。同時，對敲低或過表達METTL3的H446DDP和親本H446細胞進行RNA-seq檢測。然后，將MeRIP-seq基因集與RNA-seq基因經差異分析后取P≤0.01的交集，發(fā)現(xiàn)三個基因在三個隊列之間存在顯著差異（圖4B）。為了確定METTL3的下游靶基因，作者對三個不同的交集基因進行了熒光qPCR，發(fā)現(xiàn)DCP2是SCLC中METTL3的靶基因（圖4C-D）。來自MeRIP-seq的IGV圖也顯示，METTL3敲低后，DCP2編碼區(qū)（CDS）的m6A甲基化水平顯著降低（圖4E）。MeRIP-qPCR驗證了上述結果。在H69AR和H446DDP細胞中，METTL3敲低導致DCP2 m6A甲基化水平顯著降低，在H69和H446細胞中，METTL3過表達顯著增加DCP2 m6A甲基化水平（圖4F-G）。METTL3敲低導致DCP2蛋白水平顯著升高，而METTL3過表達顯著降低DCP2蛋白水平（圖4H-I）。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明DCP2是METTL3的靶基因，并且METTL3通過誘導DCP2的m6A甲基化來下調DCP2的表達。

圖4DCP2是METTL3的下游靶點

5. DCP2通過調控線粒體自噬影響SCLC化療耐藥

為了確定METTL3對DCP2水平的調節(jié)是否有助于SCLC的化療耐藥性，作者分別在化療耐藥和化療敏感細胞系中構建了DCP2過表達和DCP2敲低細胞。治療24 h后測定化療藥物CDDP和VP16的IC50。在敏感細胞中敲低DCP2顯著增加了化療藥物的IC50值（圖5A），而在耐藥細胞中過表達DCP2顯著降低了化療藥物的IC50值（圖5B）。進一步的挽救實驗表明，敲低METTL3后，細胞對化療藥物的敏感性增加，IC50值降低。然而，當同時敲低METTL3和DCP2時，由METTL3引起的化療耐藥性被恢復（圖5C-D）。

為了進一步探索METTL3介導化療耐藥的可能下游機制，作者對MeRIP-seq數(shù)據(jù)進行了GO通路富集分析。GO分析顯示自噬相關通路高度富集，在12條差異顯著的自噬相關通路中，有5條通路屬于“線粒體自噬伴選擇性自噬”類別（圖5E）。為明確線粒體自噬是否參與SCLC化療耐藥，利用共聚焦顯微鏡評估SCLC化療敏感和耐藥細胞的線粒體自噬。在化療耐藥細胞中過表達DCP2后，Mtphagy熒光強度顯著降低，并且這一發(fā)現(xiàn)在分析的兩個細胞系中一致（圖5F）。在化療敏感細胞中敲低DCP2后，Mtphagy熒光強度顯著增加（圖5G-H）。進一步的實驗表明，當在耐藥細胞系中敲低METTL3時，觀察到線粒體自噬減少，并且這種減少的線粒體自噬通過同時敲低METTL3和DCP2而恢復（圖5I-J）。綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)METTL3的靶基因DCP2通過影響線粒體自噬水平參與SCLC的化療耐藥過程。

圖5DCP2通過調控線粒體自噬預防SCLC化療耐藥

6. DCP2調控Pink1-Parkin通路介導的線粒體自噬

在以往的研究中，線粒體自噬通過兩種經典途徑發(fā)生:由膜去極化觸發(fā)的pink1-parkin介導的泛素依賴性途徑和受體介導的途徑，其核心成分包括BNIP3、BNIP3L/NIX和PHB2。為了探究DCP2是否通過這些已知的通路調控SCLC中的線粒體自噬，作者分析了DCP2敲低對化療敏感的細胞中線粒體自噬基因的表達變化。DCP2敲低導致Pink1和Parkin mRNA水平升高，而BNIP3、BNIP3L和PHB2的mRNA水平無顯著變化（圖6A-B）。同樣，在過表達DCP2的耐藥細胞中，Pink1和Parkin的mRNA水平降低（圖6C）。這些結果表明，DCP2影響了Pink1和Parkin的mRNA穩(wěn)定性，DCP2可以誘導Pink1和Parkin的降解。

為了進一步研究SCLC細胞中線粒體自噬的變化，作者分析了Pink1, Parkin, LC3和P62的蛋白水平。在化療敏感細胞中敲低DCP2或過表達METTL3，線粒體自噬蛋白表達水平顯著升高（圖6D-E）。此外，在耐藥細胞中過表達DCP2或敲低METTL3，線粒體自噬蛋白水平降低（圖6F-G）。

進一步的挽救實驗表明，當在耐藥細胞中同時敲低METTL3和DCP2時，敲低METTL3引起的自噬蛋白水平的變化被恢復（圖6H）。METTL3通過調控DCP2的水平，通過調控pink1-parkin介導的線粒體自噬參與SCLC化療耐藥。

圖6DCP2通過Pink1-Parkin通路調節(jié)線粒體自噬

7. DCP2調控SCLC線粒體損傷

大量研究證實，化療耐藥與線粒體功能障礙有關。線粒體自噬是通過自噬對線粒體的靶向吞噬和破壞，被認為是線粒體質量控制的主要機制。因此，作者推測SCLC化療耐藥過程中存在線粒體損傷水平的變化。線粒體膜電位（MMP）和線粒體活性氧（mtROS）是反映線粒體活性的關鍵指標，因為它們反映了電子傳遞和氧化磷酸化過程，而這兩個過程是生物過程和人類癌癥發(fā)病機制中ATP產生的驅動力。作者發(fā)現(xiàn)，在SCLC化療敏感細胞中敲低DCP2顯著減少了線粒體ROS的產生，并顯著增加了MMP（圖7A-B），表明敲低DCP2可以減輕化療藥物誘導的線粒體損傷。同樣，在化療耐藥細胞中過表達DCP2后，DCP2過表達組化療藥物誘導的線粒體損傷增加（mtROS熒光強度增加，MMP熒光強度降低）（圖7C-D）。進一步的挽救實驗表明，當在耐藥細胞中同時敲低METTL3和DCP2時，METTL3引起的化療藥物誘導的線粒體損傷得到恢復（圖7E-F）。綜上所述，METTL3在SCLC中對DCP2的調控改變了化療藥物誘導的線粒體損傷水平。

圖7DCP2調節(jié)SCLC細胞線粒體損傷水平

8. METTL3抑制劑STM2457可在體內外逆轉SCLC細胞的化療耐藥性

STM2457是一種新型、高選擇性、口服活性METTL3抑制劑，之前在一項急性白血病研究中已經報告了STM2457。用不同濃度的STM2457處理正常肺上皮細胞（HBE），確定STM2457能夠在不影響正常肺上皮細胞增殖的情況下抑制SCLC細胞METTL3表達的合適濃度。分別用CDDP和VP16處理細胞24 h，檢測IC50和細胞凋亡。經STM2457處理后，CDDP和VP16的IC50值顯著降低（圖8A-B）。流式細胞術結果也顯示，STM2457處理組的凋亡細胞比例高于對照組（圖8C-D）。

為觀察STM2457在體內是否影響SCLC的耐藥性，將6.25μM STM2457處理24 h的H69AR細胞皮下注射到裸鼠體內。與化療藥物聯(lián)用時，STM2457顯著抑制了移植瘤的生長速度，并顯著減小了化療后移植瘤的體積（圖8E-F）。綜上所述，METTL3抑制劑STM2457可以逆轉SCLC患者的化療耐藥，具有治療SCLC患者化療耐藥的潛力。

圖8METTL3抑制劑STM2457在體內外均可逆轉SCLC細胞的化療耐藥性

結論：

該研究證實m6A甲基轉移酶METTL3通過促進DCP2的m6A，誘導Pink1-Parkin通路介導線粒體自噬，減輕線粒體損傷，參與SCLC化療耐藥過程。同時，新型METTL3抑制劑STM2457也被證明具有調節(jié)SCLC化療耐藥的作用。因此，METTL3有望成為逆轉SCLC化療耐藥的新靶點。

參考文獻：

Sun Y, Shen W, Hu S, Lyu Q, Wang Q, Wei T, Zhu W, Zhang J. METTL3 promotes chemoresistance in small cell lung cancer by inducing mitophagy. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Mar 17;42(1):65.