原發(fā)性肝癌（PLC）是第六大最常見的人類癌癥類型，在全球癌癥死亡率中排名第三。肝細胞癌（HCC）是肝癌的主要組織學類型，約占PLC的90%。盡管在檢測和治療方面不斷改善，但由于肝細胞癌患者進展迅速，術后腫瘤復發(fā)和轉移的患病率高，HCC患者的遠期結局仍然較差，5年總生存率低于30%。因此，闡明HCC生長和進展的分子機制以確定新的治療靶點至關重要。長非編碼RNA CEBPA-DT是CCAAT增強子結合蛋白α（CEBPA）基因的不同轉錄本，已被證明參與多種腫瘤進展。然而，還沒有研究在HCC中建立其促癌機制。該研究發(fā)表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF: 12.658。

技術路線：

主要研究結果：

1. CEBPA-DT在肝細胞癌組織中上調(diào)，與患者預后相關

為了篩選與肝細胞癌轉移相關的lncRNA，采用RNA-seq分析術后肝外轉移患者的11個HCC組織和未發(fā)生轉移或復發(fā)的患者的11個HCC組織之間的差異表達基因，鑒定出320個顯著改變的lncRNA（圖1A）。6個lncRNA（CEBPA-DT，編號：AL136372，MEG3，DBH-AS1，TUG1，PSMA3-AS1）在肝外轉移患者的11個HCC組織中具有最高的豐度（平均FPKM > 5）。CEBPA-DT被選為進一步研究的候選lncRNA，因為它是在前面提到的6個候選lncRNA中（圖1B，C）最顯著的上調(diào)靶標（log2（倍數(shù)變化）= 5.753，P = 0.013）。此外，研究者檢查了CEBPA-DT在54個具有相應正常肝組織的肝細胞組織中的表達水平。RT-qPCR分析表明，肝癌組織中CEBPA-DT的表達顯著高于配對正常肝組織中的表達（圖1D）。在TCGA LIHC數(shù)據(jù)中的50對肝細胞癌和正常組織中也觀察到了類似的結果（圖1F）。

為了進一步評估HCC患者中CEBPA-DT表達水平的預后價值，在88個HCC組織中測量了CEBPA-DT的表達水平?；颊叻譃楦?/span>CEBPA-DT組（n=44）和低CEBPA-DT組（n=44），符合CEBPA-DT在HCC組織中的表達。較高的CEBPA-DT表達水平與血清甲胎蛋白（AFP）水平升高、腫瘤體積較大、腫瘤分化差和微血管浸潤（MVI）顯著相關，提示CEBPA-DT表達較高與肝細胞癌生長和轉移有關。Kaplan-Meier生存曲線表明，高CEBPA-DT水平組的HCC患者與低水平CEBPA-DT患者的總生存期（OS）和無復發(fā)生存期（RFS）顯著相關（圖1E）。一致地，從TCGA LIHC隊列中獲得相同的結果（圖1G）。在單因素分析中，HBsAg陽性狀態(tài)，腫瘤分化差，腫瘤大小>5cm，存在MVI，AFP>400ng/μL，遠處轉移和高CEBPA-DT表達被確定為與HCC患者OS和RFS陰暗相關的潛在危險因素。這些變量進一步包含在多元回歸模型中。結果顯示，MVI和高CEBPA-DT表達是OS和RFS的獨立危險因素。

圖1 CEBPA-DT 在伴有肝外轉移的肝細胞癌中上調(diào)，并與患者預后相關

2. CEBPA-DT促進肝癌細胞在體外和體內(nèi)的增殖和轉移

選取7個人肝癌細胞系，采用RT-qPCR檢測CEBPA-DT的表達水平，結果表明，HCCLM9、SNU-449和SK-Hep1的CEBPA-DT表達水平高于Huh7、Hep3B和PLC/PRF/5。體外功能研究表明，沉默CEBPA-DT顯著抑制HCCLM9和SNU-449細胞的細胞增殖（圖2A，B）。同時，跨孔遷移、侵襲和傷口愈合遷移試驗表明，肝癌細胞中CEBPA-DT下調(diào)后，細胞運動受到顯著抑制（圖2C-F）。此外，采用流式細胞術研究了細胞凋亡和細胞周期分布，結果表明，CEBPA-DT的耗竭顯著提高了肝癌細胞的凋亡速率（圖2G，H）。同時，在沉默CEBPA-DT后，觀察到G0/G1期肝癌細胞百分比增加，S期肝癌細胞百分比降低（圖2I，J）。接下來，通過Huh7，Hep3B和SK-Hep1細胞中的慢病毒感染構建過表達CEBPA-DT的穩(wěn)定肝癌細胞系。CEBPA-DT的過表達顯著提高了Hep3B和Huh7細胞的生長能力（圖3A，B）。在過表達肝癌細胞的CEBPA-DT中觀察到細胞運動的顯著增強（圖3C-F）。細胞凋亡試驗表明，CEBPA-DT過表達降低了Huh7和Hep3B細胞的凋亡率（圖3G，H）。細胞周期分析顯示，CEBPA-DT過表達增加了S級分，降低了G0/G1級分（圖3I，J）。

圖2 CEBPA-DT的沉默在體外抑制肝癌細胞的腫瘤生長和轉移

圖3 CEBPA-DT在體外促進肝癌細胞的腫瘤生長和轉移

研究者進一步確定了CEBPA-DT對體內(nèi)致瘤性的影響。建立CEBPA-DT沉默HCCLM9細胞和CEBPA-DT過表達SK-Hep1細胞，并皮下注射到裸鼠體內(nèi)。當CEBPA-DT被敲低時，觀察到腫瘤體積和重量顯著降低，當CEBPA-DT過表達時，獲得相反的結果（圖4A，B），表明CEBPA-DT促進體內(nèi)腫瘤生長。為進一步評價CEBPA-DT對體內(nèi)腫瘤轉移的影響，建立了肝原位植入模型和肺轉移模型。6周后，在肝臟中，CEBPA-DT沉默組觀察到的GFP熒光強度低于對照組（圖4C），當CEBPA-DT過表達時表現(xiàn)出相反的結果（圖4D）。IVIS拍攝結果表明，CEBPA-DT敲低組與比對照組更弱的肺部生物發(fā)光信號強度相關（圖4G）；同時，與空載體組相比，CEBPA-DT過表達增強了肺部的生物發(fā)光活性（圖4H）。蘇木精和伊紅（HE）染色結果顯示，CEBPA-DT沉默組的轉移灶數(shù)量均在肝臟中減少（圖4E）。相比之下，與對照組相比，CEBPA-DT過表達組的肝肺轉移灶數(shù)量增加（圖4F，J）。綜上所述，CEBPA-DT是一種促癌lncRNA，可促進肝癌細胞在體外和體內(nèi)的增殖和轉移。

圖4 CEBPA-DT促進體內(nèi)腫瘤生長和轉移

3. CEBPA-DT與RNA結合蛋白hnRNPC相互作用

為了驗證CEBPA-DT是否充當“miRNA海綿”，研究者進行了生物信息學分析，以使用Starbase評估CEBPA-DT的潛在結合miRNA。結果表明，has-miR-532-3p是最具約束力的靶標。研究者接下來建立了CEBPA-DT野生型和突變熒光素酶質(zhì)粒；通過野生型/突變的CEBPA-DT與NC模擬物/ miR-532-3p的共轉染，通過Rluc/Fluc測量相對熒光素酶活性。為了驗證CEBPA-DT是否通過與蛋白質(zhì)結合來調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉移，研究者接下來進行了生物素標記的RNA pull-down和質(zhì)譜（MS）以篩選與肝癌細胞中CEBPA-DT相互作用的蛋白質(zhì)。由于RNA FISH和先前進行的亞細胞RNA分級分離測定證明CEBPA-DT主要位于細胞核中（圖5A），僅使用核提取物進行RNA pull-down測定。銀染在近40 kD處鑒定出特定的蛋白質(zhì)條帶，隨后通過MS檢測（圖5B）。共鑒定出177種蛋白質(zhì)作為CEBPA-DT相互作用靶標。其中，RNA結合蛋白異質(zhì)核糖核蛋白C（hnRNPC）得分最高（圖5B）。

為了驗證CEBPA-DT與hnRNPC之間的相互作用，研究者確定了hnRNPC的亞細胞位置。接下來，生物素標記的RNA pull-down和RIP測定進一步證實了CEBPA-DT可以與hnRNPC相互作用（圖5C，D）。為了進一步驗證CEBPA-DT和hnRNPC之間的特異性相互作用位點，研究者構建了三個CEBPA-DT截短片段（1-750nt，751-1500nt和1501-2252nt）（圖5E），以及基于RNA識別基序（RRM，16-87aa）的截短hnRNPC片段（圖5G）。RNA pull-down測定顯示，751-1500個核苷酸負責CEBPA-DT與hnRNPC的RNA識別基序之間的相互作用（圖5F，H）。先前的一項研究證明，hnRNPC通過與c-myc相互作用，從細胞核部分地重新定位到細胞質(zhì)。研究者假設CEBPA-DT和hnRNPC之間的相互作用可以激活hnRNPC的亞細胞重定位。亞細胞蛋白分離測定顯示，CEBPA-DT的過表達上調(diào)了細胞質(zhì)中hnRNPC的蛋白水平，同時降低了細胞核中的hnRNPC水平（圖5I）。通過RNA FISH結合IF測定獲得了類似的觀察結果（圖5J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明CEBPA-DT可能在物理上結合hnRNPC并誘導hnRNPC從肝癌細胞的細胞核到細胞質(zhì)的轉定位。

圖5 CEBPA-DT與RNA結合蛋白hnRNPC相互作用

4. CEBPA-DT通過hnRNPC-DDR2軸促進肝癌細胞的轉移

更深入地了解CEBPA-DT在肝癌細胞中的致瘤作用。進行RNA測序以分析受CEBPA-DT沉默影響的轉錄組變化。聚類分析顯示，CEBPA-DT沉默HCCLM9細胞中共有2040個下調(diào)基因。不同數(shù)據(jù)庫中的進一步富集分析表明，細胞外基質(zhì)相關途徑和基因表現(xiàn)出最顯著的改變（圖6A）。這些分析的交集揭示了8個下調(diào)基因，這些基因受到RT-qPCR的影響，結果表明，沉默CEBPA-DT后，DDR2的mRNA水平下調(diào)最顯著（圖6B）。

作為普遍表達的異質(zhì)核糖核蛋白（hnRNPs）家族的成員，hnRNPC作為RBP結合核RNA，對于許多mRNA的穩(wěn)定和翻譯至關重要，通常與靶mRNA的3' UTR區(qū)域相互作用。考慮到CEBPA-DT誘導hnRNPC從細胞核向細胞質(zhì)的重新定位，以及CEBPA-DT調(diào)控DDR2 mRNA水平，研究者假設CEBPA-DT可能增強DDR2 mRNA的穩(wěn)定性，從而通過增加hnRNPC的細胞質(zhì)表達來促進翻譯。為了驗證這一猜想，研究者測量了用siRNA沉默hnRNPC后DDR2的mRNA和蛋白質(zhì)水平。結果表明，DDR2 mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著下調(diào)（圖6C，D）。更關鍵的是，在CEBPA-DT上調(diào)后，hnRNPC與DDR2 mRNA之間的相互作用明顯增強（圖6E）。總之，這些結果表明DDR2是CEBPA-DT-hnRNPC復合物的下游靶標。

研究者相繼研究了CEBPA-DT-hnRNPC軸對DDR2下調(diào)的影響機制。通過放線菌素D處理肝癌細胞，研究者發(fā)現(xiàn)CEBPA-DT的過表達降低了DDR2 mRNA的降解，延長了其半衰期，從而增加了DDR2 mRNA的表達，同時hnRNPC的缺失顯著抑制了這種促進，提高了DDR2 mRNA水平（圖6G）。一致地，在CEBPA-DT上調(diào)和hnRNPC沉默后，蛋白質(zhì)水平表現(xiàn)出相同的變化趨勢（圖6F）。

先前的一項研究闡明DDR2有助于HCC侵襲和轉移。研究者的體外功能研究表明，在沉默DDR2的mRNA和蛋白質(zhì)水平后，肝癌細胞的運動性受到顯著抑制。在功能上，傷口愈合和Transwell測定表明，CEBPA-DT的過表達可以增強肝癌細胞的運動性，而DDR2的缺失可以阻止這種增強。裸鼠肺轉移模型也獲得了類似的結果（圖6H）。此外，通過在50個HCC樣品中應用IHC和RT-qPCR，研究者發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，HCC組織中DDR2的蛋白質(zhì)和mRNA水平明顯增加（圖6I）。此外，DDR2的表達與HCC組織中CEBPA-DT的表達呈正相關（圖6J）。綜上所述，上述數(shù)據(jù)表明CEBPA-DT可以通過hnRNPC-DDR2軸促進HCC的轉移。

圖6 CEBPA-DT通過hnRNPC-DDR2軸促進肝癌細胞的轉移

5. CEBPA-DT誘導肝癌細胞中的EMT

先前的研究表明，CEBPA-DT下調(diào)改變了EMT相關基因的表達；然而，CEBPA-DT參與EMT過程的分子機制尚不清楚。本研究首先采用RT-qPCR篩選了幾種EMT標志物，包括上皮標志物E-鈣粘蛋白（CDH1）、間充質(zhì)標志物N-鈣粘蛋白（CDH2）、Vimentin（VIM）、SNAIL1、SNAIL2、ZEB1、TWIST1和FOXC1，結果表明，敲低CEBPA-DT誘導上皮標志物CDH1的表達，同時抑制間充質(zhì)標志物（CDH2、VIM、SNAIL1）的表達。同時，CEBPA-DT的過表達表現(xiàn)出相反的結果。在ZEB1，SNAIL2，TWIST1和FOXC1中沒有觀察到顯著的變化（圖7A）。為了檢查EMT轉錄因子Snail1是否被CEBPA-DT激活，將Snail1啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒轉染到肝癌細胞中。結果表明，CEBPA-DT沉默顯著降低了Snail1啟動子的活性，而上調(diào)的CEBPA-DT顯著誘導了啟動子活性（圖7B）。蛋白質(zhì)印跡實驗證實，CEBPA-DT過表達抑制了E-鈣粘蛋白的蛋白表達，誘導了肝癌細胞中N-鈣粘蛋白、Vimentin、Snail和DDR2的表達，而CEBPA-DT下調(diào)的結果相反（圖7C）。根據(jù)蛋白質(zhì)印跡測定，IF實驗表明，CEBPA-DT的消耗顯著增加了E-鈣粘蛋白的表達，并降低了Vimentin和Snail的表達（圖7D）。為了進一步驗證EMT過程是通過CEBPA-DT激活Snail1誘導的，研究者在Huh7細胞中敲低了Snail1。CEBPA-DT上調(diào)促進間充質(zhì)標志物的表達因沉默蝸牛1而減弱；在上皮標志物E-鈣粘蛋白的表達中觀察到相反的趨勢（圖7E）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明CEBPA-DT通過Snail1的轉錄激活誘導肝癌細胞中的EMT。

圖7 CEBPA-DT在肝癌細胞中誘導EMT

6. CEBPA-DT通過DDR2和β-連環(huán)蛋白之間的相互作用促進EMT過程

作為Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的核心成分，β-連環(huán)蛋白被發(fā)現(xiàn)在HCC轉移中被定期激活，并與EMT過程密切相關。因此，研究者假設β-連環(huán)蛋白參與了CEBPA-DT調(diào)節(jié)的EMT過程。首先，亞細胞蛋白分級分離顯示，細胞核組分中的β-連環(huán)蛋白表達在CEBPA-DT過表達肝癌細胞中顯著上調(diào)，在CEBPA-DT沉默細胞中下調(diào)，而細胞質(zhì)部分β-連環(huán)蛋白的表達保持不變（圖8A）。接下來，免疫熒光測定表明，在CEBPA-DT沉默時，核β-連環(huán)蛋白顯著重新定位到肝癌細胞的細胞質(zhì)中。相反，CEBPA-DT上調(diào)后促進了β連環(huán)蛋白的核易位（圖8B）。為了探索Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導的轉錄活性，進行了TOP/FOP-Flash熒光素酶報告測定，結果表明，在HCCLM9載體細胞和β連環(huán)蛋白過表達細胞中敲低CEBPA-DT降低了轉錄活性（圖8E）。

為了評價β連環(huán)蛋白對蝸牛1啟動子活性的調(diào)控能力，研究者進行了生物信息學分析，預測了β-連環(huán)蛋白在蝸牛1啟動子區(qū)域的結合位點（圖8C）。進一步的 ChIP-qPCR 測定表明 Snial1 啟動子區(qū)域的結合位點 1 上β-連環(huán)蛋白顯著富集；同時，CEBPA-DT沉默可以明顯抑制這種富集（圖8D）。

早期的一項研究已經(jīng)證明了DDR2在EMT過程中的調(diào)節(jié)作用。研究者的數(shù)據(jù)證實DDR2受CEBPA-DT監(jiān)管。因此，研究者推測DDR2和β-連環(huán)蛋白之間存在相互作用，這種相互作用是CEBPA-DT調(diào)控EMT過程所必需的。首先，使用針對DDR2的特異性抗體進行免疫共沉淀測定，結果表明DDR2確實可以與β-連環(huán)蛋白相互作用，并且在CEBPA-DT沉默后相互作用減弱，并在CEBPA-DT過表達后得到加強（圖8F）。接下來，使用一種特異性抑制劑DDR2-IN-1來抑制DDR2。隨著DDR2-IN-1的存在，由CEBPA-DT過表達調(diào)節(jié)的β-連環(huán)蛋白的核易位增加顯著耗盡（圖8G）。最后，蛋白質(zhì)印跡試驗顯示DDR2抑制可能導致CEBPA-DT誘導EMT過程的抑制;β-連環(huán)蛋白的過表達挽救了這種抑制（圖8H）。綜上所述，CEBPA-DT通過DDR2與β-連環(huán)蛋白的相互作用促進了EMT過程。

圖8 CEBPA-DT通過DDR2和β-catenin之間的相互作用促進EMT過程

結論：

綜上所述，該研究將CEBPA-DT確定為HCC轉移的效應物。此外，研究者發(fā)現(xiàn)CEBPA-DT通過與hnPNPC相互作用激活DDR2/β-連環(huán)蛋白軸來促進HCC的進展和轉移。重要的是，該研究結果為lncRNA參與HCC轉移的潛在分子機制提供了新的見解，并為進一步的CEBPA-DT靶向HCC治療方法奠定了基礎。

示意圖：

說明CEBPA-DT在肝癌轉移中的作用

參考文獻：

Cai Y, Lyu T, Li H, Liu C, Xie K, Xu L, et al. LncRNA CEBPA-DT promotes liver cancer metastasis through DDR2/β-catenin activation via interacting with hnRNPC. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Dec 6;41(1):335. doi: 10.1186/s13046-022-02544-6.