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膠質(zhì)母細胞瘤抗血管生成治療的靶點-小膠質(zhì)細胞外泌體circKIF18A

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2022-07-19
們的研究確定了M2-GAM衍生外泌體circKIF18A通過靶向FOXC2參與GBM血管生成的新分子機制。這可能為改善GBM抗血管生成治療的療效提供......


多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)是最致命的原發(fā)性腫瘤。研究GBM血管生成的新分子機制非常重要。研究發(fā)現(xiàn),M2小膠質(zhì)細胞極化與GBM患者微血管密度呈正相關。M2-膠質(zhì)瘤相關的小膠質(zhì)細胞(GAM)可通過將外泌體circKIF18A轉運到hBMECs中促進GBM的血管生成。在機制上,circKIF18A可以結合hBMECsFOXC2,維持其穩(wěn)定性和核易位。此外,作為一種轉錄因子,FOXC2可以直接與ITGB3、CXCR4DLL4的啟動子結合并上調(diào)其表達。此外,FOXC2還可以激活PI3K/AKT信號,促進GBM的血管生成。我們的研究確定了M2-GAM衍生外泌體circKIF18A通過靶向FOXC2參與GBM血管生成的新分子機制。這可能為改善GBM抗血管生成治療的療效提供一個新的治療靶點。本文于20225月發(fā)表于OncogeneIF=8.756)上。


技術路線



結果

1M2小膠質(zhì)細胞與GBM患者微血管密度相關

首先,我們分析了TCGA、CGGA、Rembrandt和Gravendel數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)M2極化標記基因(CD163、CD206、ARG1)和血管生成相關基因(CD31、CD34、vWF)之間存在正相關(圖1A)?;赥CGA和CGGA數(shù)據(jù)庫的GSEA和GSVA分析表明,CD163高表達組富含血管生成過程和信號傳導(圖1B、C)。此外,Kaplan-Meier生存分析表明,在TCGA、Rembrandt和Gravendel數(shù)據(jù)庫中,CD163和CD31高表達的患者明顯短于CD163和CD31低表達的患者(圖1D)。隨后,我們采用qPCR、免疫組化等方法檢測70例膠質(zhì)瘤患者中TMEM119、CD163、CD31的表達(圖1E)。皮爾遜相關分析顯示,CD163或TMEM119與CD31或微血管密度(MVD)之間存在很強的正相關關系(圖1F-I)。值得注意的是,CD163和TMEM119高分組的MVD高于低分組(圖1J-L)。Kaplan-Meier生存分析還表明,CD163和CD31表達較高的膠質(zhì)瘤患者的中位生存時間短于CD163和CD31表達較低的膠質(zhì)瘤患者(圖1M)。總之,這些結果表明,M2小膠質(zhì)細胞與GBM患者微血管密度呈正相關。



2M2小膠質(zhì)源性外泌體在體外和體內(nèi)促進血管生成

我們通過qPCR、western blotting和ELISA分析驗證原始HMC3的M2極化,M2標記物(CD163、CD206、ARG1、IL-6和TGF-β)顯著上調(diào),M1標記物(IL1β和TNF-α)下調(diào)(圖2A-C)。我們分離純化小膠質(zhì)細胞來源外泌體(MDE),并通過透射電鏡(TEM)觀察(圖2D)。NTA顯示,室溫下MDE的平均直徑為132 nm(圖2E)。通過western blotting檢測MDE的標記基因(CD9、CD81和TSG101)(圖2F)。此外,PKH26分析表明,HUVEC可以吸收MDEs(圖2G)。我們進一步檢測了M2-MDEs對hBMECs的直接影響。所有EDU、MTS、transwell、遷移和試管形成分析表明,與GW4869治療組和原始MDEs治療的組相比,M2- MDEs治療后hBMECs的生存能力、侵襲、遷移和試管形成能力都有所提高(圖2H-M)。總之,這些結果表明M2-MDEs在體外可以促進血管生成。

為了進一步證實M2-MDEs能夠促進體內(nèi)血管生成,我們構建了基于C57BL/6小鼠的同源GBM模型。我們將BV-2 M2或幼稚外泌體注射到GBM荷瘤小鼠體內(nèi)。結果表明,M2-MDEs治療后的腫瘤體積增大(圖2N,O)。Kaplan-Meier生存分析表明,M2-MDEs治療可比原始MDEs減少中位生存時間(圖2P)。免疫組織化學顯示,M2-MDEs治療可以上調(diào)Ki67和CD31的表達以及MVD(圖2Q,R)。因此,這些結果表明M2-MDEs在體內(nèi)可促進GBM的腫瘤發(fā)生和血管生成。



3M2-MDEscircKIF18A運輸?shù)?/span>hBMECs

在HMC3的na?ve和M2-MDEs之間進行CircRNA測序。結果顯示,有17個差異表達的circRNAs。其中,與幼稚MDEs相比,circKIF18A是M2-MDEs中上調(diào)最高的CircRNA(圖3A、B、D)。CircKIF18A是從KIF18A mRNA的轉錄本之一反向拼接而成,由其5-14個外顯子組成。Sanger測序證實了頭-尾剪接(圖3C)。瓊脂糖凝膠電泳顯示,cDNA中的發(fā)散引物擴增了circKIF18A,但gDNA沒有擴增(圖3E)。此外,RNase R處理顯示circKIF18A的表達略有變化,而其線性RNAs KIF18A明顯減少(圖3F)。FISH分析顯示,circKIF18A主要位于M2 HCM3和hBMECs的細胞質(zhì)中(圖3G)。此外,qPCR用于檢測MDEs治療后hBMECs中circKIF18A的表達,結果顯示,M2-MDEs治療后circKIF18A的表達高于幼稚MDEs治療的hBMECs(圖3H)。然后,M2-HMC3中circKIF18A的表達被敲低或過表達,并通過qPCR進行驗證(圖3I)。同樣,在circKIF18A-KD M2-MDEs治療后,qPCR也顯示circKIF18A-KD M2-MDEs(圖3J)和hBMECs(圖3K)中circKIF18A表達下調(diào)。然而,circKIF18A-OE M2-MDEs治療后的結果相反(圖3J,K)??傊?,這些結果表明circKIF18A在M2-MDEs中過表達,并可通過MDEs轉運到內(nèi)皮細胞中。MTS、EDU、transwell、遷移和試管形成分析表明,與陰性對照(NC)M2-MDEs相比,circKIF18A-KD M2-MDEs處理后,hBMECs的細胞活力、增殖、侵襲、遷移、分支數(shù)量和小管長度均減少(圖3L-P),提示M2小膠質(zhì)細胞外泌體circKIF18A在體外可促進血管生成。



4M2小膠質(zhì)細胞外泌體circKIF18A可直接與FOXC2結合

由于M2極化與GBM患者微血管密度相關,我們基于CD163在TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫中的表達進行了GSEA。我們收集了至少在兩條血管生成途徑中起作用的基因,發(fā)現(xiàn)了6個重疊基因,包括PTGS2、FLT4、SULF1、FOXC2、NRP1和VEGFA(圖4A,B)。我們進一步探討了circKIF18A與hBMECs中這些基因之間可能的分子機制。qPCR顯示,在hBMECs中,經(jīng)circKIF18A-KD或circKIF18A- OE M2-MDEs治療后,這六個基因的mRNA表達沒有持續(xù)變化(圖4C)。然而,WB顯示,在circKIF18A-KD M2-MDEs處理后,VEGFA和FOXC2表達下調(diào),而在circKIF18A-OE M2-MDEs處理后,PTGS2、NRP1、FOXC2的蛋白表達上調(diào)(圖4D)。因此,F(xiàn)OXC2可能是受circKIF18A調(diào)控的候選基因。根據(jù)catRAPID數(shù)據(jù)庫的預測,circKIF18A可以與FOXC2蛋白結合,尤其是circKIF18A的Δ291–350區(qū)域與FOXC2蛋白的Δ376–427區(qū)域之間的相互作用位點(圖4E)。RIP分析顯示,抗FOXC2組中circKIF18A的相對富集度明顯高于IgG治療組。此外,在circKIF18A-OE M2-MDEs處理后,circKIF18A的富集程度更高,而在circKIF18A-KD M2-MDEs處理后,circKIF18A的富集程度降低(圖4F)。RNA下拉分析還表明,生物素化的circKIF18A wt探針可以下拉h(huán)BMEsC中的FOXC2,而circKIF18A mt探針不能(圖4G)。此外,將FOXC2 DNA片段克隆到pCMV5質(zhì)粒中并轉染到hBMECs中。RIP分析進一步顯示,在pCMV5-Δ376–427組中,circKIF18A的富集程度更高(圖4H)。這些結果表明,circKIF18A可以直接與FOXC2蛋白結合。MG-132處理hBMECs后,由circKIF18A-KD M2-MDE引起的FOXC2蛋白表達減少得到恢復(圖4I)。CHX分析表明,在hBMECs中,經(jīng)circKIF18A-KD M2-MDEs處理后,F(xiàn)OXC2蛋白的半衰期縮短,經(jīng)circKIF18A-OE M2-MDEs處理后,F(xiàn)OXC2蛋白的半衰期延長(圖4K,L)。此外,在hBMECs中,經(jīng)circKIF18A-KD M2-MDEs處理后,F(xiàn)OXC2主要存在于細胞質(zhì)中,幾乎沒有核分布,而經(jīng)circKIF18A-OE M2-MDEs處理后,其核分布明顯增加(圖4M)。CircKIF18A-KD M2-MDEs處理下調(diào)了細胞核中FOXC2的表達,而CircKIF18A- OE M2-MDEs處理上調(diào)了細胞核中FOXC2的表達(圖4J)。因此,這些結果表明M2-HMC3通過外泌體circKIF18A誘導FOXC2穩(wěn)定性和核易位。



5M2小膠質(zhì)細胞外泌體circKIF18A通過FOXC2促進體外血管生成

為了進一步證實M2小膠質(zhì)細胞外泌體circKIF18A通過靶向FOXC2促進血管生成,hBMECs中FOXC2的表達被基于慢病毒的RNAi沉默,并且qPCR和WB驗證了這些效應(圖5A,B)。盡管使用circKIF18A-OE M2-MDEs處理,MTS、EDU、transwell、migration和tube formation實驗顯示FOXC2敲除后,與陰性對照組相比,EDU陽性hBMECs的比率、hBMECs的侵襲和遷移數(shù)量、hBMECs的分支數(shù)量和小管長度均下降(圖5C–G)。因此,這些結果表明,M2小膠質(zhì)細胞外泌體circKIF18A在體外通過FOXC2促進血管生成。



6M2小膠質(zhì)外泌體circKIF18A可促進FOXC2ITGB3、CXCR4DLL4PI3K/AKT信號通路的轉錄調(diào)控能力

我們根據(jù)Jaspar數(shù)據(jù)庫的預測進一步進行了熒光素酶報告分析和芯片分析(圖6A-D)。結果表明,在circKIF18A-KD M2-MDEs治療后,pGL3-ITGB3-wt、pGL3-CXCR4-wt和pGL3-DLL4-wt的相對熒光素酶活性均下調(diào),而在circKIF18A-OE M2-MDEs治療后,其相對熒光素酶活性增強(圖6E–J)。芯片分析還表明,在使用circKIF18A-KD M2-MDEs處理后,抗FOXC2可降低hBMECs中ITGB3、CXCR4和DLL4的富集度(圖6K),而在使用circKIF18A-OE M2-MDEs處理后獲得相反的結果(圖6L)。此外,qPCR和WB也證實了circKIF18A-KD或circKIF18A-OE M2-MDEs處理后ITGB3、CXCR4和DLL4的表達水平(圖6M-P)。據(jù)報道,F(xiàn)OXC2可以通過激活PI3K/AKT信號促進腫瘤的惡性表型。用WB檢測PI3K/AKT信號的活性。結果表明,在hBMECs中,經(jīng)circKIF18A-KD MDEs治療后,p-PI3K、p-AKT和p-MTOR的表達均下調(diào)(圖6Q),而經(jīng)circKIF18A-OE MDEs治療后,結果相反(圖6R)。



7M2小膠質(zhì)細胞外泌體circKIF18A促進體內(nèi)腫瘤生長和血管生成

Mmu_U circ_0009168是小鼠體內(nèi)circKIF18A的同源circRNA。其在BV-2中的過表達和敲除通過qPCR進行驗證(圖3E)。然后將mmu_circ_0009168-KD或mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs注射到C57BL/6小鼠的同源GBM模型中。結果表明,與NC M2-MDEs相比,mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs治療后腫瘤體積明顯增大(圖7A,B)。Kaplan-Meier生存分析表明,mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs比NC M2-MDEs能縮短中位生存時間(圖7C)。免疫組織化學顯示,mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs治療后,Ki-67、CD31和MVD的表達增加(圖7D,H)。然而,mmu_circ_0009168-KD M2-MDEs治療后的結果相反(圖7D-H)。這些結果表明,M2小膠質(zhì)細胞外泌體circKIF18A在體內(nèi)促進腫瘤的生長和血管生成。為了說明我們的發(fā)現(xiàn),圖7I中的示意圖顯示,膠質(zhì)母細胞瘤相關的小膠質(zhì)細胞來源的外泌體circKIF18A通過靶向FOXC2促進血管生成。

 


結論:M2小膠質(zhì)細胞通過運輸外泌體circKIF18A進入 hBMECs,促進GBM血管生成。從機制上講,circKIF18A可以結合hBMECs中FOXC2,維持其穩(wěn)定性和核轉位。FOXC2可以通過轉錄調(diào)控ITGB3、CXCR4、DLL4的表達,激活PI3K/AKT信號通路。我們的研究為GBM的抗血管生成治療提供了新的機制和靶點,這可能會改善抗血管生成治療的效果。


參考文獻:

Jiang Y, Zhao J, Xu J, Zhang H, Zhou J, Li H, Zhang G, Xu K, Jing Z. Glioblastoma-associated microglia-derived exosomal circKIF18A promotes angiogenesis by targeting FOXC2. Oncogene. 2022;41(26):3461-3473. doi: 10.1038/s41388-022-02360-4.


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