激素性股骨頭壞死（ONFH）是一種常見的破壞性骨疾病。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的增殖能力和成骨分化在維持股骨頭的結構和功能完整性以預防ONFH中起著關鍵作用。到目前為止，對ONFH進展過程中BMSCs分化障礙的潛在機制知之甚少。circRNAs被認為是重要的非編碼RNAs，與各種人類疾病有關。然而，circRNA是否以及如何調(diào)節(jié)ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化尚不清楚。在這項研究中，我們鑒定了182個差異表達的circRNA，其中108個circRNA上調(diào)。circHGF通過靶向miR-25-3p/SMAD7軸抑制ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化。我們的發(fā)現(xiàn)為ONFH提供了潛在的診斷和治療策略。本文于2022年3月發(fā)表在“Mol Ther Nucleic Acids”（IF=8.886）上。

技術路線

結果

1）ONFH-BMSCs中差異表達circRNA的鑒定

為了研究circRNAs在ONFH-BMSCs增殖和成骨分化中的潛在作用，我們首先篩選出ONFH-BMSCs中差異表達的circRNAs。微陣列分析結果表明，與對照組相比，ONFH-BMSCs組有182個差異表達的circRNAs，其中108個circRNAs上調(diào)，74個circRNAs下調(diào)。如層次聚類熱圖所示，兩組之間的circRNAs表達模式是可區(qū)分的，其中大多數(shù)在ONFH BMSCs中上調(diào)（圖1A）。兩組歸一化后的表達信號強度相對一致（圖1B）。火山圖顯示了每個circRNA表達的折疊變化和p值（圖1C）。Circos圖顯示了circRNAs在人類染色體上的分布，我們發(fā)現(xiàn)差異表達的circRNAs來自所有染色體（圖1D）。

3）CircHGF被鑒定為ONFH相關的環(huán)狀RNA

在circRNAs微陣列分析中，大多數(shù)差異表達的circRNAs被上調(diào)?？紤]到富含miRNA結合位點的潛在功能，我們進一步研究了前20個上調(diào)的circRNA中最顯著上調(diào)的circRNA hsa_circ_0080914。在circBase數(shù)據(jù)庫中使用人類參考基因組GRCh37/hg19標注，hsa_circ_0080914由肝細胞生長因子(HGF)基因的第6 ~ 10外顯子產(chǎn)生，位于chr7: 81346547-81374436（圖3A）。我們稱之為circRNA，circHGF，circHGF的剪接長度為780個核苷酸。PCR分析表明，發(fā)散引物在cDNA中擴增cirRNA circHGF，但在gDNA中不擴增cirRNA circHGF，收斂引物同時擴增circHGF和GAPDH（圖3B）。如圖3A（左）所示，Sanger測序證實circHGF具有環(huán)狀結構。RT-qPCR分析驗證了ONFH-BMSCs中hsa_circ_0080914的上調(diào)表達模式（圖3C）。接下來，我們用circHGF過表達（OE）載體或以siRNA轉染BMSCs，以調(diào)節(jié)其表達。結果證實，與陰性對照相比，轉染circHGF OE載體的BMSCs中 circHGF表達水平顯著上調(diào)(圖3D)，而轉染circHGF siRNA的BMSCs中 circHGF表達水平顯著下調(diào)(圖3E)。

4）CircHGF抑制ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化

我們研究了circHGF對BMSCs增殖和成骨分化的影響。細胞周期分析表明circHGF下調(diào)明顯增加了S期細胞的百分比，降低了G1期細胞的百分比（圖4A），而circHGF OE降低了S期細胞的百分比，增加了G1期細胞的百分比（圖4B）。上述結果表明，circHGF能抑制ONFH中BMSCs的增殖能力。通過western blot分析，我們發(fā)現(xiàn)在成骨誘導后，circHGF下調(diào)顯著增強了BMSCs中成骨標記基因的表達，包括ALP、BMP2、RUNX2和OCN（圖4C）。然而，circHGF-OE可明顯抑制這些成骨標記基因的表達水平（圖4D）。同時，在circHGF-siRNA轉染后第7天和第14天，通過茜素紅染色，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，BMSCs的成骨分化顯著增加（圖4E），而OE-circHGF轉染后第7天和第14天的茜素紅染色結果表明，BMSCs的成骨分化明顯減弱（圖4F）。

5）MiR-25-3p促進BMSCs的增殖和成骨分化能力

考慮到miR-25-3p被starBase在線預測為circHGF的關鍵靶向miRNA，我們探討了miR-25-3p在BMSCs中的表達模式和功能。首先，RT-qPCR分析表明，與對照組相比，ONFH-BMSCs中miR-25-3p的表達顯著下調(diào)（圖5A）。接下來，我們用miRNA mimics轉染BMSCs以過表達miR-25-3p，或用miRNA抑制劑轉染BMSCs以敲除miR-25-3p。RT-qPCR分析證實，miRNA mimics治療后，miR-25-3p表達水平明顯升高（圖5B），而miRNA抑制劑治療后，miR-25-3p表達水平降低（圖5C）。然后，通過細胞周期分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-25-3p mimics顯著增加了S期細胞的百分比，降低了G1期細胞的百分比（圖5D）。相反，miR-25-3p抑制劑處理降低了S期細胞的百分比，增加了G1期細胞的百分比（圖5E）。這些結果表明，miR-25-3p可以促進ONFH中BMSCs的增殖能力。western blot分析表明，在成骨誘導后，miR-25-3p mimics明顯增加了BMSCs中成骨標記基因（ALP、BMP2、RUNX2和OCN）的蛋白表達水平（圖5F）。相反，miR-25-3p抑制劑對BMSCs產(chǎn)生相反的作用（圖5G）。同時，在第7天和第14天使用茜素紅染色，我們發(fā)現(xiàn)，在miR-25-3p mimics組中，BMSCs的成骨分化能力顯著增強（圖5H），而在miR-25-3p抑制劑組中，BMSCs的成骨分化能力顯著降低（圖5I）。

6）MiR-25-3p通過靶向SMAD7增強BMSCs的增殖和成骨分化

據(jù)報道，SMAD7在BMSCs和ONFH的成骨分化中起著關鍵作用。使用TargetScan 7在線工具和miRDB在線數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)SMAD7是miR-25-3p的直接靶基因。接下來，我們探討了BMSCs中miR-25-3p和SMAD7之間的作用。western blot分析表明，miR-25-3p可以明顯抑制BMSCs中SMAD7的表達（圖6A）。接下來，進一步使用OE-SMAD7研究SMAD7的關鍵作用，并通過western blot分析驗證SMAD7的表達（圖6B）。細胞周期分析表明，miR-25-3p增加了BMSCs的細胞增殖，這種效應可被SMAD7部分抵消（圖6C）。通過western blot分析，我們發(fā)現(xiàn)，SMAD7也可以部分抵消miR-25-3p在BMSCs成骨分化中的作用（圖6D）。結果提示miR-25-3p通過與SMAD7相互作用，促進BMSCs的增殖和成骨分化。

7）CircHGF通過靶向miR-25-3p/SMAD7軸在BMSCs中發(fā)揮作用

基于以上結果，我們接下來探討了circHGF是否通過與miR-25-3p/SMAD7軸在BMSCs中發(fā)揮作用。通過細胞周期分析，我們發(fā)現(xiàn)circHGF敲除引起的BMSCs細胞增殖增強可被miR-25-3p抑制劑抵消（圖7A）。western blot分析表明，miR-25-3p抑制劑可以抵消circHGF siRNA對BMSCs成骨分化能力的影響（圖7B）。我們發(fā)現(xiàn)SMAD7 OE治療顯著抵消了circHGF siRNA對BMSCs增殖和成骨分化能力的影響（圖7C和7D）。此外，進一步的實驗表明，miR-25-3p mimics或SMAD7 siRNA都可以明顯抵消circHGF OE對BMSCs細胞增殖和成骨分化能力的影響（補充圖，未展示）。這些結果表明，circHGF通過靶向miR-25-3p /SMAD7軸發(fā)揮其功能。

8）CircHGF可直接與miR-25-3p相互作用，miR-25-3p可直接靶向SMAD7 3’UTR

我們進行了熒光素酶報告基因分析，以驗證circHGF和SMAD7與miR-25-3p的結合位點（圖8A和8B）。正如預期的那樣，miR-25-3p顯著抑制WT-circHGF 報告基因的熒光素酶活性，而miR-25-3p mimics和對照組之間的MUT circHGF 報告基因活性沒有顯著差異（圖8C）。同樣，miR-25-3p顯著抑制WT-SMAD7 3’UTR報告基因的熒光素酶活性，而miR-25-3p mimics和對照組之間的MUT-SMAD7 3’UTR報告基因活性沒有顯著差異（圖8D）。此外，熒光素酶活性測定顯示，miR-25-3p顯著抑制WT-SMAD7 3’UTR熒光素酶活性，而circHGF可部分逆轉這種抑制作用（圖8E）。這些結果表明，circHGF可以直接與miR-25-3p相互作用，miR-25-3p可以直接靶向SMAD7 3’UTR。

結論：我們成功繪制了激素誘導的ONFH中BMSCs的circRNAs表達譜，并鑒定了一種新的關鍵circRNA，稱為circHGF，并揭示了circHGF通過與miR-25-3p相互作用調(diào)控SMAD7抑制ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化?？傊狙芯勘砻?，靶向miR-25-3p/SMAD7軸的circHGF可能為治療激素誘導的ONFH提供一種新的診斷和治療策略。

參考文獻：Feng X, Xiang Q, Jia J, Guo T, Liao Z, Yang S, Cai X, Liu X. CircHGF suppressed cell proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs in ONFH via inhibiting miR-25-3p binding to SMAD7. Mol Ther Nucleic Acids. 2022 Mar 1;28:99-113. doi: 10.1016/j.omtn.2022.02.017.