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CircHGF抑制ONFH中BMSCs的細胞增殖和成骨分化

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2022-06-30
circHGF通過靶向miR-25-3p/SMAD7軸抑制ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化。我們的發(fā)現(xiàn)為ONFH提供了潛在的診斷和治療策略......


激素性股骨頭壞死(ONFH)是一種常見的破壞性骨疾病。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的增殖能力和成骨分化在維持股骨頭的結構和功能完整性以預防ONFH中起著關鍵作用。到目前為止,對ONFH進展過程中BMSCs分化障礙的潛在機制知之甚少。circRNAs被認為是重要的非編碼RNAs,與各種人類疾病有關。然而,circRNA是否以及如何調(diào)節(jié)ONFHBMSCs的增殖和成骨分化尚不清楚。在這項研究中,我們鑒定了182個差異表達的circRNA,其中108circRNA上調(diào)。circHGF通過靶向miR-25-3p/SMAD7軸抑制ONFHBMSCs的增殖和成骨分化。我們的發(fā)現(xiàn)為ONFH提供了潛在的診斷和治療策略。本文于20223月發(fā)表在“Mol Ther Nucleic Acids”IF=8.886)上。


技術路線



結果

1ONFH-BMSCs中差異表達circRNA的鑒定

為了研究circRNAsONFH-BMSCs增殖和成骨分化中的潛在作用,我們首先篩選出ONFH-BMSCs中差異表達的circRNAs。微陣列分析結果表明,與對照組相比,ONFH-BMSCs組有182個差異表達的circRNAs,其中108circRNAs上調(diào),74circRNAs下調(diào)。如層次聚類熱圖所示,兩組之間的circRNAs表達模式是可區(qū)分的,其中大多數(shù)在ONFH BMSCs中上調(diào)(圖1A)。兩組歸一化后的表達信號強度相對一致(圖1B)。火山圖顯示了每個circRNA表達的折疊變化和p值(圖1C)。Circos圖顯示了circRNAs在人類染色體上的分布,我們發(fā)現(xiàn)差異表達的circRNAs來自所有染色體(圖1D)。



3CircHGF被鑒定為ONFH相關的環(huán)狀RNA

circRNAs微陣列分析中,大多數(shù)差異表達的circRNAs被上調(diào)??紤]到富含miRNA結合位點的潛在功能,我們進一步研究了前20個上調(diào)的circRNA中最顯著上調(diào)的circRNA hsa_circ_0080914。在circBase數(shù)據(jù)庫中使用人類參考基因組GRCh37/hg19標注,hsa_circ_0080914由肝細胞生長因子(HGF)基因的第6 ~ 10外顯子產(chǎn)生,位于chr7: 81346547-81374436(圖3A)。我們稱之為circRNA,circHGFcircHGF的剪接長度為780個核苷酸。PCR分析表明,發(fā)散引物在cDNA中擴增cirRNA circHGF,但在gDNA中不擴增cirRNA circHGF,收斂引物同時擴增circHGFGAPDH(圖3B)。如圖3A(左)所示,Sanger測序證實circHGF具有環(huán)狀結構。RT-qPCR分析驗證了ONFH-BMSCshsa_circ_0080914的上調(diào)表達模式(圖3C)。接下來,我們用circHGF過表達(OE)載體或以siRNA轉染BMSCs,以調(diào)節(jié)其表達。結果證實,與陰性對照相比,轉染circHGF OE載體的BMSCs circHGF表達水平顯著上調(diào)(3D),而轉染circHGF siRNABMSCs circHGF表達水平顯著下調(diào)(3E)。



4CircHGF抑制ONFHBMSCs的增殖和成骨分化

我們研究了circHGFBMSCs增殖和成骨分化的影響。細胞周期分析表明circHGF下調(diào)明顯增加了S期細胞的百分比,降低了G1期細胞的百分比(圖4A),而circHGF OE降低了S期細胞的百分比,增加了G1期細胞的百分比(圖4B)。上述結果表明,circHGF能抑制ONFHBMSCs的增殖能力。通過western blot分析,我們發(fā)現(xiàn)在成骨誘導后,circHGF下調(diào)顯著增強了BMSCs中成骨標記基因的表達,包括ALP、BMP2、RUNX2OCN(圖4C)。然而,circHGF-OE可明顯抑制這些成骨標記基因的表達水平(圖4D)。同時,在circHGF-siRNA轉染后第7天和第14天,通過茜素紅染色,我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比,BMSCs的成骨分化顯著增加(圖4E),而OE-circHGF轉染后第7天和第14天的茜素紅染色結果表明,BMSCs的成骨分化明顯減弱(圖4F)。



5MiR-25-3p促進BMSCs的增殖和成骨分化能力

考慮到miR-25-3pstarBase在線預測為circHGF的關鍵靶向miRNA,我們探討了miR-25-3pBMSCs中的表達模式和功能。首先,RT-qPCR分析表明,與對照組相比,ONFH-BMSCsmiR-25-3p的表達顯著下調(diào)(圖5A)。接下來,我們用miRNA mimics轉染BMSCs以過表達miR-25-3p,或用miRNA抑制劑轉染BMSCs以敲除miR-25-3pRT-qPCR分析證實,miRNA mimics治療后,miR-25-3p表達水平明顯升高(圖5B),而miRNA抑制劑治療后,miR-25-3p表達水平降低(圖5C)。然后,通過細胞周期分析,我們發(fā)現(xiàn)miR-25-3p mimics顯著增加了S期細胞的百分比,降低了G1期細胞的百分比(圖5D)。相反,miR-25-3p抑制劑處理降低了S期細胞的百分比,增加了G1期細胞的百分比(圖5E)。這些結果表明,miR-25-3p可以促進ONFHBMSCs的增殖能力。western blot分析表明,在成骨誘導后,miR-25-3p mimics明顯增加了BMSCs中成骨標記基因(ALP、BMP2、RUNX2OCN)的蛋白表達水平(圖5F)。相反,miR-25-3p抑制劑對BMSCs產(chǎn)生相反的作用(圖5G)。同時,在第7天和第14天使用茜素紅染色,我們發(fā)現(xiàn),在miR-25-3p mimics組中,BMSCs的成骨分化能力顯著增強(圖5H),而在miR-25-3p抑制劑組中,BMSCs的成骨分化能力顯著降低(圖5I)。



6MiR-25-3p通過靶向SMAD7增強BMSCs的增殖和成骨分化

據(jù)報道,SMAD7BMSCsONFH的成骨分化中起著關鍵作用。使用TargetScan 7在線工具和miRDB在線數(shù)據(jù)庫,我們發(fā)現(xiàn)SMAD7miR-25-3p的直接靶基因。接下來,我們探討了BMSCsmiR-25-3pSMAD7之間的作用。western blot分析表明,miR-25-3p可以明顯抑制BMSCs中SMAD7的表達(圖6A)。接下來,進一步使用OE-SMAD7研究SMAD7的關鍵作用,并通過western blot分析驗證SMAD7的表達(圖6B)。細胞周期分析表明,miR-25-3p增加了BMSCs的細胞增殖,這種效應可被SMAD7部分抵消(圖6C)。通過western blot分析,我們發(fā)現(xiàn),SMAD7也可以部分抵消miR-25-3p在BMSCs成骨分化中的作用(圖6D)。結果提示miR-25-3p通過與SMAD7相互作用,促進BMSCs的增殖和成骨分化。



7CircHGF通過靶向miR-25-3p/SMAD7軸在BMSCs中發(fā)揮作用

基于以上結果,我們接下來探討了circHGF是否通過與miR-25-3p/SMAD7軸在BMSCs中發(fā)揮作用。通過細胞周期分析,我們發(fā)現(xiàn)circHGF敲除引起的BMSCs細胞增殖增強可被miR-25-3p抑制劑抵消(圖7A)。western blot分析表明,miR-25-3p抑制劑可以抵消circHGF siRNABMSCs成骨分化能力的影響(圖7B)。我們發(fā)現(xiàn)SMAD7 OE治療顯著抵消了circHGF siRNABMSCs增殖和成骨分化能力的影響(圖7C7D)。此外,進一步的實驗表明,miR-25-3p mimicsSMAD7 siRNA都可以明顯抵消circHGF OEBMSCs細胞增殖和成骨分化能力的影響(補充圖,未展示)。這些結果表明,circHGF通過靶向miR-25-3p /SMAD7軸發(fā)揮其功能。



8CircHGF可直接與miR-25-3p相互作用,miR-25-3p可直接靶向SMAD7 3’UTR

我們進行了熒光素酶報告基因分析,以驗證circHGFSMAD7miR-25-3p的結合位點(圖8A8B)。正如預期的那樣,miR-25-3p顯著抑制WT-circHGF 報告基因的熒光素酶活性,而miR-25-3p mimics和對照組之間的MUT circHGF 報告基因活性沒有顯著差異(圖8C)。同樣,miR-25-3p顯著抑制WT-SMAD7 3’UTR報告基因的熒光素酶活性,而miR-25-3p mimics和對照組之間的MUT-SMAD7 3’UTR報告基因活性沒有顯著差異(圖8D)。此外,熒光素酶活性測定顯示,miR-25-3p顯著抑制WT-SMAD7 3’UTR熒光素酶活性,而circHGF可部分逆轉這種抑制作用(圖8E)。這些結果表明,circHGF可以直接與miR-25-3p相互作用,miR-25-3p可以直接靶向SMAD7 3’UTR。



結論:我們成功繪制了激素誘導的ONFH中BMSCs的circRNAs表達譜,并鑒定了一種新的關鍵circRNA,稱為circHGF,并揭示了circHGF通過與miR-25-3p相互作用調(diào)控SMAD7抑制ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化??傊狙芯勘砻?,靶向miR-25-3p/SMAD7軸的circHGF可能為治療激素誘導的ONFH提供一種新的診斷和治療策略。


參考文獻:Feng X, Xiang Q, Jia J, Guo T, Liao Z, Yang S, Cai X, Liu X. CircHGF suppressed cell proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs in ONFH via inhibiting miR-25-3p binding to SMAD7. Mol Ther Nucleic Acids. 2022 Mar 1;28:99-113. doi: 10.1016/j.omtn.2022.02.017.


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