上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一個與轉(zhuǎn)移和耐藥性相關(guān)的過程，非編碼RNA（ncRNAs）起著關(guān)鍵作用。我們之前的研究表明，嵌入ncRNA宿主基因MIR100HG第三內(nèi)含子的miR-100和miR-125b在結(jié)直腸癌（CRC）中對西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥性。然而，MIR100HG轉(zhuǎn)錄本本身是否在西妥昔單抗耐藥性或EMT中起作用尚不清楚。MIR100HG的表達與EMT標記物密切相關(guān)，并作為EMT的陽性調(diào)節(jié)因子。MIR100HG在體外和體內(nèi)均能維持西妥昔單抗耐藥性，促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。hnRNPA2B1被鑒定為MIR100HG的結(jié)合蛋白。在機制上，MIR100HG通過與hnRNPA2B1相互作用，維持了TCF7L2的mRNA穩(wěn)定性，TCF7L2是Wnt/β-catenin的主要轉(zhuǎn)錄輔激活因子。hnRNPA2B1在MIR100HG存在下識別TCF7L2 mRNA的m6A位點。TCF7L2反過來激活MIR100HG轉(zhuǎn)錄，形成前饋調(diào)節(jié)回路。MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2軸在出現(xiàn)局部或遠處轉(zhuǎn)移或與西妥昔單抗耐藥相關(guān)的疾病進展的CRC患者中得到增強。我們的研究發(fā)現(xiàn)，MIR100HG是結(jié)腸癌中一種有效的EMT誘導劑，通過激活MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2反饋回路，可能有助于西妥昔單抗耐藥性和轉(zhuǎn)移。本文于2021年3月發(fā)表于Molecular Cancer（IF=27.401）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）MIR100HG與結(jié)腸癌EMT密切相關(guān)，并參與其調(diào)節(jié)

我們之前描述了從人類HCA-7細胞中產(chǎn)生西妥昔單抗敏感CC細胞和西妥昔單抗耐藥CC-CR細胞。使用1型膠原在3D培養(yǎng)中培養(yǎng)的CC細胞產(chǎn)生中空的全極化結(jié)構(gòu)。相比之下，大多數(shù)CC-CR細胞表現(xiàn)出堅實、無組織的結(jié)構(gòu)，失去了頂-基底極性（圖1a）。細胞極性的喪失被認為是癌癥進展的標志，上皮細胞經(jīng)歷間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一個重要步驟。與CC細胞相比，CC-CR細胞顯示E-鈣粘蛋白介導的粘附連接缺失，緊密連接蛋白ZO-1減少，間充質(zhì)標記物N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達增加（圖1b、c）。包括Snail、Twist和ZEB家族成員在內(nèi)的EMT誘導轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs）在CC-CR細胞中的表達也升高（圖1c）。這些特征表明EMT發(fā)生在3D培養(yǎng)的CC-CR細胞中。

由于與CC相比，MIR100HG是CC-CR中過表達最多的轉(zhuǎn)錄本，因此我們研究了MIR100HG是否參與了EMT。我們首先在一個大的人類CRC數(shù)據(jù)集中分析了MIR100HG和EMT基因表達特征列表之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MIR100HG和EMT高度相關(guān)（圖1d）。通過使用分子特征數(shù)據(jù)庫中的EMT-hallmark基因集，我們通過GSEA證明EMT基因表達模式在高水平MIR100HG的結(jié)腸癌樣本中顯著富集（圖1e）。此外，對TCGA CRC數(shù)據(jù)庫的分析顯示，MIR100HG與間充質(zhì)基因或EMT-TF的表達之間存在很強的正相關(guān)(圖1f)。此外，MIR100HG過表達的CC細胞顯示E-鈣粘蛋白表達減少，間充質(zhì)基因和EMT-TFs表達增加；相比之下，在MIR100HG^KOE4細胞中觀察到這些基因的表達增加（圖1g和h）。在通過反義寡核苷酸（ASOs）轉(zhuǎn)染MIR100HG過表達或敲除后，SW480（低內(nèi)源性MIR100HG表達）和SW620（中度內(nèi)源性MIR100HG表達）細胞中觀察到類似的結(jié)果（圖1i、j）。總之，這些結(jié)果表明MIR100HG在結(jié)腸癌中誘導EMT。

2）MIR100HG對維持西妥昔單抗耐藥性和促進結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移很重要

我們研究了MIR100HG是否參與了結(jié)腸癌的耐藥性和轉(zhuǎn)移，以及與EMT密切相關(guān)的表型。我們首先分析了29個結(jié)直腸癌細胞系中西妥昔單抗的反應性，這些細胞系由基于基因表達的共識分子分型（CMS）分層。我們發(fā)現(xiàn)CMS2和CMS3分類中的細胞對西妥昔單抗治療有反應，而CMS4間充質(zhì)組中的細胞表現(xiàn)出西妥昔單抗耐藥性（圖2a），支持EMT在結(jié)腸癌中賦予西妥昔單抗耐藥性。在3D培養(yǎng)中，MIR100HG^KOE4 CC-CR細胞的菌落數(shù)與WT細胞相當；然而，在西妥昔單抗存在的情況下，與WT相比，MIR100HG^KOE4細胞的菌落數(shù)量顯著減少（圖2b）。西妥昔單抗治療后，在MIR100HG^KOE4 CC-CR細胞中觀察到Ki-67減少和cleaved caspase-3染色增加（圖2c）。恢復全長MIR100HG轉(zhuǎn)錄本（MIR100HG-FL）在很大程度上消除了MIR100HG^KOE4 CC-CR細胞對西妥昔單抗的反應性（圖2d）。為了確定這些發(fā)現(xiàn)是否可以在體內(nèi)重現(xiàn)，我們用表達熒光素酶的慢病毒載體轉(zhuǎn)導的MIR100HG^KOE4 CC-CR細胞在裸鼠皮下建立異種移植物，然后用西妥昔單抗治療小鼠（圖2e）。與對照組相比，西妥昔單抗治療后MIR100HG^KOE4組的體內(nèi)生物發(fā)光以及腫瘤體積和重量顯著降低（圖2f和g）。這些結(jié)果表明，MIR100HG對維持結(jié)直腸癌細胞對西妥昔單抗的耐藥性很重要，降低MIR100HG水平可以恢復藥物敏感性。
   接下來我們確定MIR100HG是否與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。對TCGA數(shù)據(jù)庫的分析顯示，有轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的MIR100HG表達顯著高于無轉(zhuǎn)移的患者（圖2h）。MIR100HG在SW480細胞和DIF細胞中的上調(diào)顯著增加遷移和侵襲（圖2i）。相比之下，SW620細胞和HCT116細胞中MIR100HG的敲除阻礙了它們的遷移和侵襲能力（圖2j）。此外，我們通過將MIR100HG沉默的SW620或LoVo細胞注射到裸鼠的尾靜脈中來進行體內(nèi)轉(zhuǎn)移試驗。與對照組相比，注射MIR100HG沉默細胞的小鼠表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移減少，整體生物發(fā)光信號和肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量表明了這一點，并提高了存活率（圖2k-n）。這些結(jié)果表明MIR100HG促進了腫瘤的侵襲，增強了結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移能力。

3）hnRNPA2B1是MIR100HG的直接功能性結(jié)合伙伴

lncRNAs發(fā)揮作用的方式之一是直接與RNA結(jié)合蛋白相互作用。由于MIR100HG主要位于細胞核內(nèi)，我們通過ChIRP結(jié)合質(zhì)譜分析，以確定CRC細胞中MIR100HG的核定位相互作用伙伴。我們從CC-CR和HCT116細胞中分別分離出173和76個純化蛋白（圖3a）。其中，五個候選基因hnRNPA2B1、SUPT16H、SNRNP70、DKC1和PES1在所有組中均富集（圖3a）。hnRNPA2B1被選為進一步研究的對象，因為據(jù)報道它是各種癌癥類型中的EMT調(diào)節(jié)因子。在CC-CR和HCT116細胞中證實了MIR100HG探針富集hnRNPA2B1（圖3a），并通過RIP分析進一步驗證，與對照IgG相比，使用抗hnRNPA2B1的抗體，MIR100HG在下拉中顯著富集（圖3b）。為了確定與hnRNPA2B1結(jié)合的MIR100HG的特定區(qū)域，根據(jù)RNA fold web服務器（圖3c）預測的MIR100HG二級結(jié)構(gòu)生成了一系列MIR100HG片段，然后將這些構(gòu)建體用于生物素標記的RNA下拉分析。結(jié)果表明，hnRNPA2B1主要與從核苷酸2170到3100轉(zhuǎn)錄的MIR100HG片段結(jié)合（圖3d）。此外，使用帶有Flag標簽的全長或截短hnRNPA2B1抗體進行RIP分析，以闡明hnRNPA2B1介導與MIR100HG相互作用的特定結(jié)構(gòu)域（圖3e）。結(jié)果顯示hnRNPA2B1的RNA識別基序2（RRM2）結(jié)構(gòu)域主要負責與MIR100HG的相互作用（圖3f）。然后我們研究了hnRNPA2B1在結(jié)腸癌進展中的作用。hnRNPA2B1的沉默增加了CC-CR和LoVo細胞中E-鈣粘蛋白的表達，降低了波形蛋白的表達，這與MIR100HG對EMT的影響一致（圖3g）。在3D培養(yǎng)中，敲除CC-CR細胞中的hnRNPA2B1可減少總菌落數(shù)，而西妥昔單抗治療的減少更為明顯，這表明hnRNPA2B1可促進西妥昔單抗耐藥性（圖3h）。同時，hnRNPA2B1的敲除顯著阻礙了細胞遷移和侵襲（圖3i）。接下來，我們試圖闡明hnRNPA2B1在MIR100HG介導的西妥昔單抗耐藥性和轉(zhuǎn)移中的作用。沉默hnRNPA2B1可逆轉(zhuǎn)CC和SW480細胞中MIR100HG過表達介導的E-cadherin減少（圖3j）。在西妥昔單抗存在的情況下，MIR100HG^KOE4 CC-CR細胞的集落數(shù)減少，這部分被hnRNPA2B1過表達所抵消（圖3k）。敲除hnRNPA2B1也消除了MIR100HG過表達細胞的遷移和侵襲能力增強（圖3l）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明MIR100HG通過與hnRNPA2B1的相互作用促進CRC進展。

4）MIR100HG和hnRNPA2B1調(diào)節(jié)TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定性并激活Wnt信號

我們推測某些mRNAs可能受到MIR100HG和hnRNPA2B1之間相互作用的影響。為了分析受MIR100HG和hnRNPA2B1調(diào)節(jié)的候選mRNA，我們沉默了MIR100HG或hnRNPA2B1，并進行了RNA測序。值得注意的是，TCF7L2被確定為所有MIR100HG-和hnRNPA2B1沉默組中唯一一個顯著下調(diào)的基因（圖4a）。因為我們之前的研究表明MIR100HG和Wnt信號之間存在正相關(guān)，我們決定集中精力研究TCF7L2，因為它是Wnt信號的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄輔激活因子，與耐藥性、轉(zhuǎn)移和EMT密切相關(guān)。如圖4b所示，敲除MIR100HG或hnRNPA2B1可降低CC-CR和HCT116細胞中TCF7L2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達，而MIR100HG或hnRNPA2B1的過表達增加了CC和SW480細胞中TCF7L2 mRNA和蛋白質(zhì)水平。hnRNPs是已知的RNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)因子。為了測試HRNPA2B1是否會影響TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定性，我們用放線菌素D處理細胞，并檢測TCF7L2 mRNA水平。在CC-CR和HCT116細胞（圖4c）中證實了hnRNPA2B1敲除后TCF7L2 mRNA的加速衰變，表明hnRNPA2B1起到穩(wěn)定TCF7L2 mRNA的作用。MIR100HG的敲除也增強了TCF7L2 mRNA的降解（圖4d）。MIR100HG的過表達延長了CC和Caco-2細胞中TCF7L2 mRNA的半衰期，但hnRNPA2B1的沉默消除了MIR100HG的穩(wěn)定作用（圖4e）。這些結(jié)果表明HRNPA2B1和MIR100HG通過增強mRNA穩(wěn)定性協(xié)同上調(diào)TCF7L2的表達。接下來我們確定TCF7L2是否參與MIR100HG或hnRNPA2B1介導的CRC進展。TCF7L2在MIR100HG或hnRNPA2B1缺失的CRC細胞中的過表達挽救了西妥昔單抗耐藥性、細胞遷移和侵襲（圖4f、g）?；謴?/span>TCF7L2誘導的EMT，其被MIR100HG或hnRNPA2B1下調(diào)抑制（圖4h）。接下來，我們研究了MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2軸的功能是否通過激活Wnt信號來介導。在MIR100HG或hnRNPA2B1敲除后，TOP/FOP flash活性受到顯著抑制，而TCF7L2過表達可緩解這種抑制，尤其是在給予標準Wnt配體Wnt3A后（圖4i）。此外，與細胞生長（c-Myc和Cyclin D1）和EMT（ZEB1和Slug）相關(guān)的Wnt靶基因子集在MIR100HG-和hnRNPA2B1過表達的CC細胞中顯著上調(diào)（圖4j，k）。相反，MIR100HG和hnRNPA2B1的敲除導致CC-CR細胞中這些Wnt靶基因的減少（圖4j，k）?？傊?，這些結(jié)果表明MIR100HG通過與hnRNPA2B1相互作用增強TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定性，并隨后激活Wnt信號通路。

5）hnRNPA2B1和MIR100HG對TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定作用依賴于m6A

由于hnRNPA2B1是m6A依賴性核RNA處理事件的介質(zhì)，我們推測hnRNPA2B1可能以m6A依賴性的方式調(diào)節(jié)TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定性。我們發(fā)現(xiàn)CC-CR和HCT116細胞中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的沉默降低了TCF7L2 mRNA水平（圖5a）。MeRIP檢測進一步證實，METTL3沉默降低了TCF7L2 mRNA的m6A修飾水平(圖5b)。使用SRAMP在線工具確定了TCF7L2 mRNA中五個預測的m6A位點，然后通過MeRIP分析進行驗證（圖5c）。用m6A抗體下拉后，TCF7L2 mRNA的最大富集是終止密碼子附近3’UTR中的+2133位點（圖5c）。接下來，我們確定hnRNPA2B1和TCF7L2之間的相互作用是否取決于m6A修飾。RIP檢測表明，在CC-CR和HCT116細胞中，hnRNPA2B1抗體可富集TCF7L2 mRNA(圖5d)，表明hnRNPA2B1和TCF7L2 mRNA之間存在相互作用。METTL3的敲除降低了這種富集（圖5e），表明TCF7L2 mRNA上的m6A修飾對于其與hnRNPA2B1的相互作用是必要的。值得注意的是，在MIR100HG^KOE4 CC-CR和HCT116細胞中，HRNPA2B1沉淀的TCF7L2 mRNA顯著減少（圖5f），這意味著HRNPA2B1和TCF7L2之間的相互作用也依賴于MIR100HG。此外，我們進行了體內(nèi)RNA沉淀分析，以驗證hnRNPA2B1和TCF7L2之間的相互作用是否依賴于m6A。在這種情況下，含有WT或突變+2133 m6A修飾位點的TCF7L2片段被S1m標記（圖5g），S1m是一種修飾的鏈霉親和素結(jié)合適體，其作用類似于生物素，但具有更高的親和力。利用將S1m標記的TCF7L2構(gòu)建物轉(zhuǎn)染CC和HCT8細胞的系統(tǒng)，可以在體內(nèi)進行m6A修飾?；阪溍褂H和素適體的捕獲顯示TCF7L2的m6A位點突變消除了與hnRNPA2B1的關(guān)聯(lián)（圖5g）。這表明TCF7L2 mRNA的m6A修飾對于其與hnRNPA2B1的關(guān)聯(lián)至關(guān)重要。此外，我們構(gòu)建了攜帶WT或突變體TCF7L2序列的熒光素酶報告基因。異位hnRNPA2B1誘導WT報告基因的熒光素酶活性顯著增加，但這種增加被HCT8和HEK293T細胞m6A位點突變削弱（圖5h和i）。hnRNPA2B1介導的熒光素酶活性的增加被METTL3或MIR100HG敲除所阻斷（圖5j和k）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明TCF7L2 mRNA的m6A修飾是其與hnRNPA2B1結(jié)合所必需的，MIR100HG是相互作用不可或缺的伙伴。

6）TCF7L2激活MIR100HG轉(zhuǎn)錄并形成一個互惠的正反饋回路

為了進一步探索MIR100HG在CC-CR細胞中上調(diào)的機制，我們使用JASPAR數(shù)據(jù)庫分析了MIR100HG 2-kb啟動子區(qū)域中預測的TF結(jié)合基序。值得注意的是，在MIR100HG啟動子中發(fā)現(xiàn)了四個TCF7L2結(jié)合位點（圖6a）。與此一致，CC-CR和HCT116細胞中TCF7L2的沉默導致MIR100HG表達減少（圖6b），表明TCF7L2可能是MIR100HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器。TCF7L2的過表達增強了CC和Caco-2細胞中MIR100HG的表達（圖6b）。為了確定TCF7L2是否激活MIR100HG轉(zhuǎn)錄，將含有MIR100HG啟動子中TCF7L2結(jié)合位點的熒光素酶報告構(gòu)建體轉(zhuǎn)導到CC-CR和HCT116細胞中（圖6c）。MIR100HG啟動子的序列缺失分析和定點突變表明，TCF7L2結(jié)合位點1和2是TCF7L2介導的轉(zhuǎn)錄激活的主要位點（圖6d和e）。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析證實TCF7L2蛋白在TCF7L2結(jié)合位點1和2直接結(jié)合到MIR100HG啟動子（圖6f）。此外，在一組CRC細胞系以及TCGA數(shù)據(jù)庫中觀察到TCF7L2和MIR100HG表達之間存在正相關(guān)（圖6g和h）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明MIR100HG和TCF7L2之間存在相互調(diào)節(jié)機制，其中MIR100HG和hnRNPA2B1穩(wěn)定TCF7L2 mRNA，而TCF7L2通過轉(zhuǎn)錄激活提高MIR100HG豐度（圖6i）。

7）結(jié)腸癌標本中MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2表達的驗證

為了檢測MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2軸是否在結(jié)腸癌患者的西妥昔單抗耐藥性中起作用，我們在西妥昔單抗治療開始前和腫瘤進展時從12名個體中獲得了成對的腫瘤標本。使用顯色RNAscope原位雜交，我們發(fā)現(xiàn)，與治療前相比，西妥昔單抗治療進展的腫瘤中，MIR100HG和TCF7L2顯著過表達（圖7a和b）。在使用西妥昔單抗進展的腫瘤的連續(xù)切片中也觀察到hnRNPA2B1免疫反應性增加（圖7a和b）。觀察到MIR100HG或hnRNPA2B1與TCF7L2表達之間存在正相關(guān)（圖7c）。這些結(jié)果表明，在結(jié)腸癌患者中，西妥昔單抗耐藥時，MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2的表達上調(diào)。接下來，我們分析了14對原發(fā)性結(jié)直腸癌組織、鄰近非腫瘤組織及其匹配的淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移樣本中MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2的表達。與原發(fā)性病變相比，淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移的MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2的表達顯著增加（圖7d-f）。在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織和轉(zhuǎn)移性病變中，MIR100HG或hnRNPA2B1與TCF7L2表達之間也存在正相關(guān)性（圖7g和h）。這些結(jié)果提示MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2在這些CRC患者的轉(zhuǎn)移灶中較原發(fā)灶表達增加。

結(jié)論：我們的研究結(jié)果揭示了一個以前未知的作用—MIR100HG通過形成涉及hnRNPA2B1和TCF7L2的調(diào)控回路，調(diào)控CRC中EMT相關(guān)的西妥昔單抗耐藥和轉(zhuǎn)移。

參考文獻：

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