淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是頭頸部鱗癌（HNSCC）患者預(yù)后不良的主要原因。N6甲基腺苷（m6A）RNA修飾是一種新興的基因表達(dá)表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，IGF2BP2作為一種新的m6A讀取器蛋白參與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。然而，目前對(duì)IGF2BP2在中的功能作用知之甚少，IGF2BP2是否通過(guò)m6A修飾在HNSCC中調(diào)節(jié)淋巴轉(zhuǎn)移仍有待確定。目前，有相關(guān)研究于2022年1月發(fā)表在《JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH》，IF: 11.161。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.   m6A調(diào)控因子在HNSCC中的表達(dá)及臨床意義

為了研究m6A修飾在HNSCC中的作用，從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析了502個(gè)HNSCC和44個(gè)正常組織中20個(gè)m6A相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)譜。如圖1A和B所示，與正常組織相比，HNSCC組織中20個(gè)m6A調(diào)控基因中有18個(gè)顯著上調(diào)，包括6個(gè)writers（VIRMA、ZC3H13、METTL14、METTL3、WTAP和RBM15）、2個(gè)erasers（FTO和ALKBH5）和10個(gè)readers（IGF2BP2、IGF2BP1、IGF2BP3、YTHDF3、YTHDF2、YTHDC1、YTHDF1、HNRNPC、RBMX和HNRNPA2B1）。HNSCC組織和正常組織中YTHDC2和RBM15B的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。臨床相關(guān)性中，只有IGF2BP2的高表達(dá)與HNSCC患者較低的生存概率相關(guān)（圖1C）。Kaplan-Meier生存分析、多變量cox回歸分析后和病理N分期均表示IGF2BP2被確定為HNSCC中潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物（圖1C-1G）。

圖1 m6A調(diào)控因子在HNSCC中的表達(dá)及臨床意義

2.   IGF2BP2在HNSCC組織中的高表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)

臨床組織樣本中q-PCR和western blot均表示IGF2BP2在HNSCC腫瘤樣本中過(guò)表達(dá)（圖2A,2B）。通過(guò)臨床病理特征和隨訪數(shù)據(jù)，IGF2BP2在NATs中表達(dá)量較低，在未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的HNSCC組織中表達(dá)量略有升高，但在有淋巴轉(zhuǎn)移的HNSCC組織中表達(dá)量強(qiáng)烈上調(diào)（圖2E,2F），且IGF2BP2高表達(dá)與較低的OS概率相關(guān)（圖2G）。此外，臨床病理特征分析顯示，IGF2BP2表達(dá)與病理N分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（表1）。單因素和多因素Cox回歸分析顯示，IGF2BP2表達(dá)是HNSCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素（表2）?？傊?，這些結(jié)果表明，在HNSCC中IGF2BP2高表達(dá)，并在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

圖2 IGF2BP2在HNSCC組織中高表達(dá)，與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)

3.   IGF2BP2在體外促進(jìn)HNSCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為

為了明確IGF2BP2是否能誘導(dǎo)HNSCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，對(duì)IGF2BP3進(jìn)行敲降和過(guò)表達(dá)。通過(guò)RT-qPCR和western blot驗(yàn)證了敲除和過(guò)表達(dá)的有效性（圖3A,3B）。創(chuàng)傷愈合分析表明，IGF2BP2的敲除抑制了FaDu和SCC15細(xì)胞的遷移能力，而過(guò)表達(dá)IGF2BP2后則出現(xiàn)相反的結(jié)果（圖3C,3D）。Transwell分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，顯示沉默IGF2BP2可減弱FaDu和SCC15細(xì)胞的遷移性和侵襲性，而過(guò)表達(dá)IGF2BP2則增強(qiáng)了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明IGF2BP2促進(jìn)HNSCC細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖3 IGF2BP2促進(jìn)體外HNSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為

4.  在體內(nèi)，IGF2BP2基因敲除可抑制淋巴轉(zhuǎn)移和淋巴管生成

為了進(jìn)一步確定IGF2BP2在HNSCC淋巴轉(zhuǎn)移中的作用，使用裸鼠建立腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型（圖4A）。RT-qPCR和western blot驗(yàn)證IGF2BP2的沉默效率（圖4B,4C），然后將這些細(xì)胞注射插入裸鼠中。4周后，通過(guò)體內(nèi)生物發(fā)光成像檢測(cè)IGF2BP2對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移的影響。IGF2BP2基因敲除顯著抑制了HNSCC細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移（圖4D）。此外，sh-IGF2BP2組的腳掌腫瘤和腘窩淋巴結(jié)均比sh-NC組小、輕，提示IGF2BP2抑制了HNSCC的腫瘤發(fā)生和淋巴轉(zhuǎn)移（圖4E-J）。此外，sh-IGF2BP2組的LN轉(zhuǎn)移率低于sh-NC組（圖4K）。免疫組化分析顯示，沉默IGF2BP2顯著降低了小鼠組織瘤內(nèi)和瘤周區(qū)域的微淋巴管密度水平，這由lyve1陽(yáng)性微血管表明（圖4L）。這些結(jié)果表明，在體內(nèi)，IGF2BP2基因敲除顯著抑制淋巴轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。

圖4體內(nèi)IGF2BP2基因敲除抑制淋巴轉(zhuǎn)移和淋巴管生成

5.   IGF2BP2調(diào)控HNSCC細(xì)胞的EMT程序

為了分析IGF2BP2在調(diào)節(jié)EMT中的作用，用TGF-β處理FaDu和SCC15細(xì)胞。72小時(shí)后，觀察到細(xì)胞-細(xì)胞接觸減少，梭形形態(tài)為間充質(zhì)細(xì)胞（圖5A）。此外，免疫熒光染色和共聚焦成像分析顯示，經(jīng)TGF-β處理的FaDu和SCC15細(xì)胞形成了廣泛的絲狀足和板狀足，如白色箭頭所示，使細(xì)胞獲得了遷移和侵襲能力（圖5B）。此外，western blot分析顯示，TGF-β誘導(dǎo)兩種HNSCC細(xì)胞E-Cadherin表達(dá)減少，這被認(rèn)為是EMT轉(zhuǎn)移的標(biāo)志（圖5C）。這些數(shù)據(jù)表明，經(jīng)TGF-β處理的HNSCC細(xì)胞系處于EMT過(guò)程中。

RT-qPCR和western blot分析顯示，在經(jīng)TGF-β處理的FaDu和SCC15細(xì)胞中，IGF2BP2缺失可下調(diào)N-Cadherin和vimentin的表達(dá)水平，而E- cadherin在mRNA和蛋白水平上上調(diào)（圖5D-E）。免疫熒光染色和共聚焦成像分析進(jìn)一步證實(shí)，沉默IGF2BP2導(dǎo)致波形蛋白表達(dá)的丟失，同時(shí)在兩種HNSCC細(xì)胞的細(xì)胞表面E-Cadherin的保留，這表明IGF2BP2可能調(diào)節(jié)EMT程序（圖5F）。為了進(jìn)一步證實(shí)IGF2BP2在EMT中的作用，在沒(méi)有TGF-β處理的情況下，用IGF2BP2和相應(yīng)的對(duì)照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)FaDu和SCC15細(xì)胞，檢測(cè)了EMT相關(guān)標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)E-Cadherin確實(shí)下調(diào)了，而N-Cadherin和vimentin在mRNA和蛋白水平均上調(diào)（圖5G-H）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明IGF2BP2在調(diào)節(jié)HNSCC細(xì)胞的EMT程序中具有重要的功能。

圖5 IGF2BP2調(diào)控HNSCC細(xì)胞EMT程序

6.   在HNSCC細(xì)胞中，Slug參與IGF2BP2調(diào)控的EMT

在HNSCC的TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，spearman相關(guān)分析顯示，與Snail、ZEB1和Twist相比，在502份HNSCC組織樣本中，Slug和IGF2BP2之間的正相關(guān)性最強(qiáng)，表明在HNSCC中IGF2BP2和Slug之間可能存在正調(diào)控機(jī)制(圖6A)。此外，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，從IGF2BP2^high表達(dá)的HNSCC組織到IGF2BP2^low表達(dá)的HNSCC組織，再到正常的鄰近組織，均觀察到Slug的表達(dá)水平顯著降低(圖6B)。RT-qPCR和western blot分析顯示，抑制IGF2BP2顯著降低了FaDu和SCC15細(xì)胞中mRNA和蛋白水平的Slug表達(dá)，而過(guò)表達(dá)IGF2BP2顯著增強(qiáng)了Slug的表達(dá)(圖6C-F)。同時(shí)，在FaDu和SCC15細(xì)胞中，Snail、ZEB1和Twist的mRNA水平無(wú)顯著或一致的變化(圖6C)。western blot分析結(jié)果顯示，在FaDu細(xì)胞中，敲除Slug可拮抗過(guò)表達(dá)IGF2BP2誘導(dǎo)的波形蛋白上調(diào)和E-Cadherin下調(diào)(圖6G)。相反，在FaDu細(xì)胞中，IGF2BP2過(guò)表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了由Slug抑制引起的波形蛋白下調(diào)和E-Cadherin上調(diào)(圖6G)。此外，創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)表明，沉默Slug可減弱FaDu細(xì)胞中IGF2BP2過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用(圖6H)。另外，IGF2BP2高表達(dá)標(biāo)本表現(xiàn)為高Slug表達(dá)，而IGF2BP2低表達(dá)標(biāo)本表現(xiàn)為低至中等Slug表達(dá)(圖6I)。根據(jù)免疫組化定量評(píng)分，IGF2BP2與Slug表達(dá)呈穩(wěn)健的正相關(guān)(r =0.752, p-value < 0.001)(圖6 j)。這些發(fā)現(xiàn)表明，Slug在IGF2BP2調(diào)控的HNSCC EMT中具有關(guān)鍵作用。

圖6 Slug參與了HNSCC細(xì)胞中IGF2BP2調(diào)節(jié)的EMT

7.   IGF2BP2通過(guò)修飾m6A調(diào)控slug mRNA的穩(wěn)定性

使用抗IGF2BP2抗體在FaDu和SCC15細(xì)胞中進(jìn)行了RIP-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示與IgG對(duì)照組相比，Slug mRNA顯著富集，證實(shí)了IGF2BP2和Slug mRNA之間的相互作用(圖7A)。為了驗(yàn)證Slug是否受m6A修飾的影響，從而導(dǎo)致IGF2BP2識(shí)別甲基化Slug，我們進(jìn)行了MeRIP qPCR分析，并確定與相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞相比，IGF2BP2的敲除顯著降低了FaDu和SCC15細(xì)胞中Slug的m6A水平（圖7B）?；?/span>SRAMP軟件分析，在Slug mRNA的CDS區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非?？尚诺?/span>m6A位點(diǎn)(圖7C)。為了驗(yàn)證假設(shè)的m6A位點(diǎn)，使用含有野生型(WT) Slug-CDS或突變型(MT) Slug-CDS序列的熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行了檢測(cè)(圖7D)。如預(yù)期的那樣，當(dāng)IGF2BP2沉默時(shí)，SlugWT的熒光素酶活性顯著減弱，而Slug-MT的熒光素酶活性似乎不受影響(圖7E)。此外，mRNA穩(wěn)定性分析顯示，在FaDu和SCC15細(xì)胞中，IGF2BP2沉默后，Slug mRNA的表達(dá)量降低，且Slug mRNA的半衰期持續(xù)縮短(圖7F)。總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明IGF2BP2以m6A修飾依賴(lài)的方式直接將CDS區(qū)與Slug mRNA結(jié)合并穩(wěn)定其mRNA。

圖7 IGF2BP2通過(guò)修飾m6A調(diào)控slug mRNA的穩(wěn)定性

結(jié)論：

綜上所述，該研究首次揭示了IGF2BP2在促進(jìn)HNSCC淋巴轉(zhuǎn)移中的臨床和生物學(xué)功能，并證明IGF2BP2通過(guò)穩(wěn)定Slug mRNA，以m6A依賴(lài)的方式促進(jìn)EMT和細(xì)胞轉(zhuǎn)移（圖7G）。這些結(jié)果表明，IGF2BP2可以作為LN轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，也是HNSCC患者抗轉(zhuǎn)移治療的潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Yu D, Pan M, Li Y, Lu T, Wang Z, Liu C, Hu G. RNA N6-methyladenosine reader IGF2BP2 promotes lymphatic metastasis and epithelial-mesenchymal transition of head and neck squamous carcinoma cells via stabilizing slug mRNA in an m6A-dependent manner. J Exp Clin Cancer Res. 2022, 41(1):6.