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RNA N6甲基腺苷讀取器IGF2BP2以m6A依賴(lài)的方式穩(wěn)定slug mRNA促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-02-17
目前對(duì)IGF2BP2在中的功能作用知之甚少,IGF2BP2是否通過(guò)m6A修飾在HNSCC中調(diào)節(jié)淋巴轉(zhuǎn)移仍有待確定......



淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是頭頸部鱗癌(HNSCC)患者預(yù)后不良的主要原因。N6甲基腺苷(m6ARNA修飾是一種新興的基因表達(dá)表觀遺傳調(diào)控機(jī)制,IGF2BP2作為一種新的m6A讀取器蛋白參與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。然而,目前對(duì)IGF2BP2在中的功能作用知之甚少,IGF2BP2是否通過(guò)m6A修飾在HNSCC中調(diào)節(jié)淋巴轉(zhuǎn)移仍有待確定。目前,有相關(guān)研究于20221月發(fā)表在《JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH》,IF: 11.161。


技術(shù)路線:


主要研究結(jié)果:

1.   m6A調(diào)控因子在HNSCC中的表達(dá)及臨床意義

為了研究m6A修飾在HNSCC中的作用,從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析了502個(gè)HNSCC44個(gè)正常組織中20個(gè)m6A相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)譜。如圖1AB所示,與正常組織相比,HNSCC組織中20個(gè)m6A調(diào)控基因中有18個(gè)顯著上調(diào),包括6個(gè)writersVIRMA、ZC3H13、METTL14METTL3、WTAPRBM15)、2個(gè)erasersFTOALKBH5)和10個(gè)readersIGF2BP2、IGF2BP1、IGF2BP3、YTHDF3YTHDF2、YTHDC1YTHDF1、HNRNPC、RBMXHNRNPA2B1)。HNSCC組織和正常組織中YTHDC2RBM15B的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。臨床相關(guān)性中,只有IGF2BP2的高表達(dá)與HNSCC患者較低的生存概率相關(guān)(圖1C)。Kaplan-Meier生存分析、多變量cox回歸分析后和病理N分期均表示IGF2BP2被確定為HNSCC中潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物(圖1C-1G)。

1 m6A調(diào)控因子在HNSCC中的表達(dá)及臨床意義


2.   IGF2BP2HNSCC組織中的高表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)

臨床組織樣本中q-PCRwestern blot均表示IGF2BP2HNSCC腫瘤樣本中過(guò)表達(dá)(圖2A,2B)。通過(guò)臨床病理特征和隨訪數(shù)據(jù),IGF2BP2NATs中表達(dá)量較低,在未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的HNSCC組織中表達(dá)量略有升高,但在有淋巴轉(zhuǎn)移的HNSCC組織中表達(dá)量強(qiáng)烈上調(diào)(圖2E,2F),且IGF2BP2高表達(dá)與較低的OS概率相關(guān)(圖2G)。此外,臨床病理特征分析顯示,IGF2BP2表達(dá)與病理N分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(表1)。單因素和多因素Cox回歸分析顯示,IGF2BP2表達(dá)是HNSCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素(表2)??傊?,這些結(jié)果表明,在HNSCCIGF2BP2高表達(dá),并在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

2 IGF2BP2HNSCC組織中高表達(dá),與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)




3.   IGF2BP2在體外促進(jìn)HNSCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為

為了明確IGF2BP2是否能誘導(dǎo)HNSCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力,對(duì)IGF2BP3進(jìn)行敲降和過(guò)表達(dá)。通過(guò)RT-qPCRwestern blot驗(yàn)證了敲除和過(guò)表達(dá)的有效性(圖3A,3B)。創(chuàng)傷愈合分析表明,IGF2BP2的敲除抑制了FaDuSCC15細(xì)胞的遷移能力,而過(guò)表達(dá)IGF2BP2后則出現(xiàn)相反的結(jié)果(圖3C,3D)。Transwell分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果,顯示沉默IGF2BP2可減弱FaDuSCC15細(xì)胞的遷移性和侵襲性,而過(guò)表達(dá)IGF2BP2則增強(qiáng)了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移??傊?,這些數(shù)據(jù)表明IGF2BP2促進(jìn)HNSCC細(xì)胞的遷移和侵襲。

3 IGF2BP2促進(jìn)體外HNSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為


4.  
在體內(nèi),IGF2BP2基因敲除可抑制淋巴轉(zhuǎn)移和淋巴管生成

為了進(jìn)一步確定IGF2BP2HNSCC淋巴轉(zhuǎn)移中的作用,使用裸鼠建立腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型(圖4A)。RT-qPCRwestern blot驗(yàn)證IGF2BP2的沉默效率(圖4B,4C),然后將這些細(xì)胞注射插入裸鼠中。4周后,通過(guò)體內(nèi)生物發(fā)光成像檢測(cè)IGF2BP2對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移的影響。IGF2BP2基因敲除顯著抑制了HNSCC細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移(圖4D)。此外,sh-IGF2BP2組的腳掌腫瘤和腘窩淋巴結(jié)均比sh-NC組小、輕,提示IGF2BP2抑制了HNSCC的腫瘤發(fā)生和淋巴轉(zhuǎn)移(圖4E-J)。此外,sh-IGF2BP2組的LN轉(zhuǎn)移率低于sh-NC組(圖4K)。免疫組化分析顯示,沉默IGF2BP2顯著降低了小鼠組織瘤內(nèi)和瘤周區(qū)域的微淋巴管密度水平,這由lyve1陽(yáng)性微血管表明(圖4L)。這些結(jié)果表明,在體內(nèi),IGF2BP2基因敲除顯著抑制淋巴轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。

4體內(nèi)IGF2BP2基因敲除抑制淋巴轉(zhuǎn)移和淋巴管生成


5.   
IGF2BP2調(diào)控HNSCC細(xì)胞的EMT程序

為了分析IGF2BP2在調(diào)節(jié)EMT中的作用,用TGF-β處理FaDuSCC15細(xì)胞。72小時(shí)后,觀察到細(xì)胞-細(xì)胞接觸減少,梭形形態(tài)為間充質(zhì)細(xì)胞(圖5A)。此外,免疫熒光染色和共聚焦成像分析顯示,經(jīng)TGF-β處理的FaDuSCC15細(xì)胞形成了廣泛的絲狀足和板狀足,如白色箭頭所示,使細(xì)胞獲得了遷移和侵襲能力(圖5B)。此外,western blot分析顯示,TGF-β誘導(dǎo)兩種HNSCC細(xì)胞E-Cadherin表達(dá)減少,這被認(rèn)為是EMT轉(zhuǎn)移的標(biāo)志(圖5C)。這些數(shù)據(jù)表明,經(jīng)TGF-β處理的HNSCC細(xì)胞系處于EMT過(guò)程中。

RT-qPCRwestern blot分析顯示,在經(jīng)TGF-β處理的FaDuSCC15細(xì)胞中,IGF2BP2缺失可下調(diào)N-Cadherinvimentin的表達(dá)水平,而E- cadherinmRNA和蛋白水平上上調(diào)(圖5D-E)。免疫熒光染色和共聚焦成像分析進(jìn)一步證實(shí),沉默IGF2BP2導(dǎo)致波形蛋白表達(dá)的丟失,同時(shí)在兩種HNSCC細(xì)胞的細(xì)胞表面E-Cadherin的保留,這表明IGF2BP2可能調(diào)節(jié)EMT程序(圖5F)。為了進(jìn)一步證實(shí)IGF2BP2EMT中的作用,在沒(méi)有TGF-β處理的情況下,用IGF2BP2和相應(yīng)的對(duì)照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)FaDuSCC15細(xì)胞,檢測(cè)了EMT相關(guān)標(biāo)記物,發(fā)現(xiàn)E-Cadherin確實(shí)下調(diào)了,而N-CadherinvimentinmRNA和蛋白水平均上調(diào)(圖5G-H)。綜上所述,這些發(fā)現(xiàn)表明IGF2BP2在調(diào)節(jié)HNSCC細(xì)胞的EMT程序中具有重要的功能。

5 IGF2BP2調(diào)控HNSCC細(xì)胞EMT程序


6.   
HNSCC細(xì)胞中,Slug參與IGF2BP2調(diào)控的EMT

HNSCCTCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中,spearman相關(guān)分析顯示,與Snail、ZEB1Twist相比,在502HNSCC組織樣本中,SlugIGF2BP2之間的正相關(guān)性最強(qiáng),表明在HNSCCIGF2BP2Slug之間可能存在正調(diào)控機(jī)制(6A)。此外,根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),從IGF2BP2high表達(dá)的HNSCC組織到IGF2BP2low表達(dá)的HNSCC組織,再到正常的鄰近組織,均觀察到Slug的表達(dá)水平顯著降低(6B)。RT-qPCRwestern blot分析顯示,抑制IGF2BP2顯著降低了FaDuSCC15細(xì)胞中mRNA和蛋白水平的Slug表達(dá),而過(guò)表達(dá)IGF2BP2顯著增強(qiáng)了Slug的表達(dá)(6C-F)。同時(shí),在FaDuSCC15細(xì)胞中,SnailZEB1TwistmRNA水平無(wú)顯著或一致的變化(6C)。western blot分析結(jié)果顯示,在FaDu細(xì)胞中,敲除Slug可拮抗過(guò)表達(dá)IGF2BP2誘導(dǎo)的波形蛋白上調(diào)和E-Cadherin下調(diào)(6G)。相反,在FaDu細(xì)胞中,IGF2BP2過(guò)表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了由Slug抑制引起的波形蛋白下調(diào)和E-Cadherin上調(diào)(6G)。此外,創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)表明,沉默Slug可減弱FaDu細(xì)胞中IGF2BP2過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用(6H)。另外,IGF2BP2高表達(dá)標(biāo)本表現(xiàn)為高Slug表達(dá),而IGF2BP2低表達(dá)標(biāo)本表現(xiàn)為低至中等Slug表達(dá)(6I)。根據(jù)免疫組化定量評(píng)分,IGF2BP2Slug表達(dá)呈穩(wěn)健的正相關(guān)(r =0.752, p-value < 0.001)(6 j)。這些發(fā)現(xiàn)表明,SlugIGF2BP2調(diào)控的HNSCC EMT中具有關(guān)鍵作用。

6 Slug參與了HNSCC細(xì)胞中IGF2BP2調(diào)節(jié)的EMT


7.   
IGF2BP2通過(guò)修飾m6A調(diào)控slug mRNA的穩(wěn)定性

使用抗IGF2BP2抗體在FaDuSCC15細(xì)胞中進(jìn)行了RIP-qPCR檢測(cè),結(jié)果顯示與IgG對(duì)照組相比,Slug mRNA顯著富集,證實(shí)了IGF2BP2Slug mRNA之間的相互作用(7A)。為了驗(yàn)證Slug是否受m6A修飾的影響,從而導(dǎo)致IGF2BP2識(shí)別甲基化Slug,我們進(jìn)行了MeRIP qPCR分析,并確定與相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞相比,IGF2BP2的敲除顯著降低了FaDuSCC15細(xì)胞中Slugm6A水平(圖7B)?;?/span>SRAMP軟件分析,在Slug mRNACDS區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非??尚诺?/span>m6A位點(diǎn)(7C)。為了驗(yàn)證假設(shè)的m6A位點(diǎn),使用含有野生型(WT) Slug-CDS或突變型(MT) Slug-CDS序列的熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行了檢測(cè)(7D)。如預(yù)期的那樣,當(dāng)IGF2BP2沉默時(shí),SlugWT的熒光素酶活性顯著減弱,而Slug-MT的熒光素酶活性似乎不受影響(7E)。此外,mRNA穩(wěn)定性分析顯示,在FaDuSCC15細(xì)胞中,IGF2BP2沉默后,Slug mRNA的表達(dá)量降低,且Slug mRNA的半衰期持續(xù)縮短(7F)。總的來(lái)說(shuō),這些發(fā)現(xiàn)表明IGF2BP2m6A修飾依賴(lài)的方式直接將CDS區(qū)與Slug mRNA結(jié)合并穩(wěn)定其mRNA。

7 IGF2BP2通過(guò)修飾m6A調(diào)控slug mRNA的穩(wěn)定性


結(jié)論:

綜上所述,該研究首次揭示了IGF2BP2在促進(jìn)HNSCC淋巴轉(zhuǎn)移中的臨床和生物學(xué)功能,并證明IGF2BP2通過(guò)穩(wěn)定Slug mRNA,以m6A依賴(lài)的方式促進(jìn)EMT和細(xì)胞轉(zhuǎn)移(圖7G)。這些結(jié)果表明,IGF2BP2可以作為LN轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物,也是HNSCC患者抗轉(zhuǎn)移治療的潛在靶點(diǎn)。


參考文獻(xiàn):

Yu D, Pan M, Li Y, Lu T, Wang Z, Liu C, Hu G. RNA N6-methyladenosine reader IGF2BP2 promotes lymphatic metastasis and epithelial-mesenchymal transition of head and neck squamous carcinoma cells via stabilizing slug mRNA in an m6A-dependent manner. J Exp Clin Cancer Res. 2022, 41(1):6.


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