FOXO1對于調(diào)節(jié)細胞因子和趨化因子非常關(guān)鍵，但是它在腫瘤微環(huán)境中的功能一直未能明確。在這篇文章中，作者表征了FOXO1的預(yù)后價值，以及腫瘤來源的FOXO1和M2巨噬細胞在ESCC中的相互作用。本文于2020年9月16發(fā)表在《Theranostics》IF：8.579。

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果如下：

1、過表達FOXO1預(yù)示ESCC的不良預(yù)后和高M2巨噬細胞浸潤

52對ESCC病人樣本中檢測FOXO1的表達，結(jié)果顯示腫瘤組織中顯著高于對照，隨后在144例樣本中驗證了該結(jié)果。生存曲線表明FOXO1高表達與患者不良預(yù)后相關(guān)（圖1A-C）。

隨后使用RNA測序從三株ESCC腫瘤中鑒定到22種免疫細胞浸潤，其中CD4記憶檢測T細胞，M2巨噬細胞，和單核細胞在ESCC中的浸潤水平最高（圖1D）。但是TCGA和實驗數(shù)據(jù)分析顯示，免疫細胞中只有M2巨噬細胞標志物CD206在FOXO1高表達組顯著上調(diào)，隨后組織（圖1E-F）。腫瘤組織的病理評估揭示更多的巨噬細胞，尤其是CD206陽性的巨噬細胞，會在腫瘤高表達FOXO1的腫瘤間質(zhì)邊緣浸潤（圖1G-H）。

圖1在ESCC病人中，過表達FOXO1與較差的生存結(jié)果和高M2巨噬細胞浸潤相關(guān)

 2、FOXO1促進M2巨噬細胞浸潤異種腫瘤

作者將FOXO1(+)和FOXO1(-)腫瘤細胞注射于裸鼠兩側(cè)，3周后取腫瘤進行檢測。結(jié)果顯示FOXO1(+)組的M2巨噬細胞浸潤水平顯著高于FOXO1(-)組。此外，CD68在FOXO1(+)腫瘤組織中過表達，提示腫瘤來源的FOXO1在體內(nèi)可促進巨噬細胞浸潤。FOXO1(+)腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞主要為CD206陽性。

圖2 M2巨噬細胞浸潤小鼠模型

 3、FOXO1調(diào)節(jié)CCL20的表達

此前的研究表明，TNF-α刺激FOXO1過表達會顯著放大NF-κB依賴的CCL20的產(chǎn)生。此外，CCR6是CCL20的受體，在多種髓細胞系表達，包括巨噬細胞。所以進一步研究FOXO1是否影響CCL20的表達，結(jié)果顯示在FOXO1(+)的腫瘤細胞中CCL20上調(diào)表達，干擾FOXO1則CCL20的表達下調(diào)（圖3A-D）。

4、FOXO1(+)的腫瘤細胞通過CCL20分泌促進M2巨噬細胞募集

作者發(fā)現(xiàn)當與FOXO1(+)的腫瘤細胞孵育后M2巨噬細胞的遷移顯著增加了（圖3E）。隨后用CCL20的重組蛋白處理M2巨噬細胞發(fā)現(xiàn)其遷移也顯著增加，但是使用CCL20的抗體預(yù)處理后則M2巨噬細胞的遷移降低了。與此一致，干擾FOXO1(+)的后M2巨噬細胞的遷移也顯著下降（圖3E-G）。這些結(jié)果表明FOXO1是通過分泌CCL20介導(dǎo)M2巨噬細胞遷移。

圖3 FOXO1(+)腫瘤細胞通過分泌CCL20促進M2巨噬細胞募集

 5、FOXO1(+)腫瘤細胞促進M0巨噬細胞向M2巨噬細胞極化

作者構(gòu)建了ESCC腫瘤細胞與M0巨噬細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，流式檢測結(jié)果顯示當兩者共培養(yǎng)時M2巨噬細胞的組分（CD163+/CD68+）顯著增加了（圖4A）。相反，敲除FOXO1則M2極化顯示受損（圖4B）。為了全面評估誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化表型，分析了其標志物的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXO1誘導(dǎo)的M2巨噬細胞顯著高表達CD206, CD163, IL10, CCL18, CLEC7A,和STAT6（圖4C）。而GSEA結(jié)果顯示FOXO1誘導(dǎo)的M0巨噬細胞具有與IL-4刺激的M2巨噬細胞類似的分子特征（圖4D-E）。表明FOXO1誘導(dǎo)的巨噬細胞都是M2巨噬細胞。

6、CSF-1介導(dǎo)FOXO1誘導(dǎo)的M0巨噬細胞極化

CCL20是作者發(fā)現(xiàn)的FOXO1誘導(dǎo)M0巨噬細胞向M2極化的第一個細胞因子，但是作者發(fā)現(xiàn)CCL20并不能顯著影響M2巨噬細胞標志物的表達。于是作者依據(jù)前人的研究猜測CSF-1可能也在M2巨噬細胞分化中扮演了重要作用。結(jié)果表明CSF-1在FOXO1(+)腫瘤細胞中顯著上調(diào)（圖4F-H）。隨后還發(fā)現(xiàn)，沉默FOXO1后CSF-1的過表達顯著減少了，并且FOXO1抗體顯著參與了CSF-1啟動子的片段的富集（圖4FI-J）。隨后，將FOXO1(+)腫瘤細胞與M0巨噬細胞在CSF-1抗體存在的情況下進行共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD163+/CD68+的比例顯著下降，而CSF-1刺激后CD206，CD163和CCL18的表達顯著上調(diào)，CD163+/CD68+的比例也顯著升高（圖4K-L）。

圖4 FOXO1(+)腫瘤細胞通過產(chǎn)生CSF-1促進M0巨噬細胞向M2巨噬細胞極化

 7、FOXO1通過M2巨噬細胞介導(dǎo)FAK/PI3K/AKT信號促進腫瘤細胞增殖和遷移

M2巨噬細胞分泌腫瘤促進因子，包括Arg-1，TGF-b和CCL18，這些都與腫瘤進展相關(guān)。為了探究M2巨噬細胞對腫瘤的促進作用，作者將M2的條件培養(yǎng)基與ESCC腫瘤細胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示其顯著促進ESCC細胞的增殖和集落形成（圖5A-B）。進一步在體內(nèi)驗證其促腫瘤作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照相比，M2條件培養(yǎng)基處理過的ESCC細胞的成瘤更大（圖5D）。接著作者探究了M2促進腫瘤生長的通路。結(jié)果顯示，M2調(diào)節(jié)培養(yǎng)基處理過后，增強了FAK，PI3K和 AKT的磷酸化（圖5E）。為了驗證M2介導(dǎo)的激活，使用PI3K抑制劑LY294002阻斷結(jié)果發(fā)現(xiàn)AKT的激活被顯著抑制（圖5F）。LY294002處理后經(jīng)M2條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的集落形成，細胞活力和增殖都顯著減少了（圖5G）。這些結(jié)果表明M2巨噬細胞激活了FAK/PI3K/AKT通路促進腫瘤增殖。

據(jù)報道CCL18參與了多種癌癥的FAK/PI3K/AKT通路和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，因此，收集M0，M2和FOXO1(+)/(-)誘導(dǎo)的M0巨噬細胞以檢測CCL18的濃度。結(jié)果顯示，M2巨噬細胞中CCL18的表達顯著上調(diào)（圖J）。此外，CCL18重組蛋白能激活FAK/PI3K/AKT通路（圖K）?？傊?，盡管M2巨噬細胞和腫瘤細胞間的相互影響較為復(fù)雜，但是這些結(jié)果表明由M2巨噬細胞分泌的CCL18是其相互關(guān)聯(lián)的因子之一。

圖5 M2巨噬細胞通過FAK/PI3K/AKT信號通路促進腫瘤細胞增殖和遷移

參考文獻：

Wang Ying., Lyu Zhaojie., Qin Yanru., Wang Xia., Sun Liangzhan., Zhang Yu., Gong Lanqi., Wu Shayi., Han Shuo., Tang Ying., Jia Yongxu., Kwong Dora Lai-Wan., Kam NgarWoon., Guan Xin-Yuan.(2020). FOXO1 promotes tumor progression by increased M2 macrophage infiltration in esophageal squamous cell carcinoma. Theranostics, 10(25), 11535-11548. doi:10.7150/thno.45261