肺癌是全球范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)的死亡率的主要原因。腺癌是肺癌的主要組織學(xué)亞型，占肺癌病例大約40％。盡管最近多模式療法方面取得了進(jìn)展，但肺腺癌的總體5年生存率仍約為15％。這主要是由于晚期診斷和缺乏有效的治療靶點(diǎn)。肺腺癌的發(fā)展是一個多步驟的，不斷發(fā)展過程，其中涉及環(huán)境暴露和分子改變，包括種系變異，體細(xì)胞變異，轉(zhuǎn)錄和外遺傳改變的多樣性之間的相互作用。

最近，通過整合多維組學(xué)數(shù)據(jù)，癌癥基因組圖譜（TCGA）小組對肺腺癌進(jìn)行了分析，并確定了幾種致癌途徑中具有可靶向候選物的分子亞型。但是，由于腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，肺腺癌發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制仍然難以捉摸。盡管一些肺腺癌相關(guān)增強(qiáng)子RNA（eRNAs）已經(jīng)TCGA樣本中描述了，但它們的轉(zhuǎn)錄表觀、分子特征以及中國肺腺癌中的臨床應(yīng)用在很大程度上仍然未知。

近日，南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院全球衛(wèi)生中心流行病學(xué)教研室的馬紅霞教授及其團(tuán)隊通過整合來自南京肺癌隊列（NJLCC）的80例肺腺癌患者的全基因組測序（WGS）和RNA-seq，提出肺腺癌中eRNA的全基因組檢測和表征，并在481例TCGA肺腺癌患者中進(jìn)一步評估了基于eRNA的分子亞型的分子特征和預(yù)后價值。相關(guān)研究以“Comprehensive characterization of functional eRNAs in lung adenocarcinoma reveals novel regulators and a prognosis-related molecular subtype”為題發(fā)表在Theranostics雜志上，雜志影響因子為8.579。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1、  肺腺癌中的eRNA

作者用80個NJLCC肺腺癌腫瘤旁正常對的RNA-seq數(shù)據(jù)，全面分析了48453個先前注釋的增強(qiáng)子（FANTOM5和ENCODE）的表達(dá)信號（圖A），共檢測到11937個eRNAs，在超過10%的樣本中有表達(dá)，包括1552個外顯子，3297個基因間和7088個內(nèi)含子eRNAs（圖B）。此外，將3297個中位長度為699 bp(75 ~ 6598 bp)的基因間eRNA納入以下分析，以避免轉(zhuǎn)錄基因的影響。腫瘤樣本在整體水平（所有eRNA的表達(dá)組合）（圖C）和個體水平（每個eRNA的表達(dá)）的eRNA表達(dá)均顯著高于癌旁正常樣本，其中15.68%的eRNA在腫瘤樣本中高表達(dá)，7.19%在癌旁樣本中高表達(dá)（圖D）。

2、  吸煙暴露影響eRNA表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控

當(dāng)評估按年齡、性別或吸煙史劃分的亞組間eRNA的表達(dá)差異時，發(fā)現(xiàn)eRNA表達(dá)與年齡或性別無相關(guān)性（圖A）。然而，吸煙者的正常組織中eRNA表達(dá)比不吸煙者顯著升高，正常吸煙者的表達(dá)水平與腫瘤樣本中的表達(dá)水平相當(dāng)（圖B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，吸煙暴露和腫瘤發(fā)生的過程都會影響eRNAs的表觀遺傳修飾。共表達(dá)和GSEA分析闡明了4組樣本（吸煙者和非吸煙者的腫瘤樣本以及正常癌旁樣本）中3297個eRNAs的生物學(xué)功能（圖C）。在腫瘤（吸煙者和非吸煙者）樣本中發(fā)現(xiàn)的eRNA相關(guān)基因主要參與免疫系統(tǒng)相關(guān)通路，即適應(yīng)性免疫應(yīng)答通路，在腫瘤非吸煙者中鑒定出的eRNA相關(guān)基因也參與細(xì)胞周期相關(guān)通路，即染色體分離通路。在正常（吸煙者和非吸煙者）樣本中鑒定出的基因主要參與修飾和mRNA代謝過程相關(guān)途徑。當(dāng)使用Reactome和KEGG數(shù)據(jù)集時，在不吸煙者的腫瘤樣本中復(fù)制細(xì)胞周期和免疫系統(tǒng)相關(guān)通路中eRNA相關(guān)基因的特異性富集（圖D-E）。

3、  癌癥驅(qū)動基因和臨床可操作基因在eRNA相關(guān)基因中過度表達(dá)

為了確定肺腫瘤發(fā)生過程中的eRNAs相關(guān)基因，我們在腫瘤樣本中建立了一個整體的eRNA-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并確定了14267個與3204個eRNAs有顯著表達(dá)相關(guān)性的PCGs，其中9239個位于2471個共表達(dá)eRNAs的同一染色體。eRNAs和相關(guān)基因之間的距離直方圖隨著距離的增加而急劇衰減，并在一個Mbp距離內(nèi)表現(xiàn)出顯著的富集（圖A）。52.56% PCGs被定位到少于3個不同的eRNAs（圖B），而55.00%的eRNAs被預(yù)測與少于10個相關(guān)PCGs相互作用（圖C）。然后，從癌癥基因普查（CGC）中收集了615個候選癌癥驅(qū)動基因和135個癌癥臨床可操作基因（CAGs），并確定81.46%的CGC基因和82.96%的CAGs與eRNA相關(guān)。這兩組癌癥相關(guān)基因在eRNA相關(guān)基因中明顯過度表達(dá)，應(yīng)用GSEA方法時也觀察到相似的結(jié)果（圖D-E）。

4、  基于eRNAs的功能性聚類與基因組畸變相關(guān)

基于共表達(dá)的eRNA-PCG對，作者將188個（129個上調(diào)，59個下調(diào)）共表達(dá)上調(diào)或下調(diào)PCGs的eRNAs定義為進(jìn)行一系列過濾過程后肺腺癌的功能性eRNA-PCG對，基于這188個eRNA的共有聚類分析得到了3個穩(wěn)健的簇（簇1、簇2和簇3）（圖A），盡管三個簇中的患者具有相似的表達(dá)水平，但兩種最常見的癌癥基因組事件類型（體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)改變）差異很大（圖B）。簇1中的患者表現(xiàn)出正常樣基因組模式，基因組改變水平最低；然而，SETD2（一種已確定的肺腺癌突變驅(qū)動基因）僅在這些患者中發(fā)生突變；集群2中的患者富集了吸煙者和具有中位突變率水平和拷貝數(shù)改變水平；由于簇3中的患者具有最高水平的基因組改變，許多基因的拷貝數(shù)改變被過度表達(dá)，如TERC、PTPRD和MYC。由于簇3中的患者表現(xiàn)出最高的基因組不穩(wěn)定性水平，我們確定與其他兩組患者相比，該組患者中下調(diào)的基因主要參與來自NJLCC和TCGA項目的免疫相關(guān)通路（圖 C）。然后，作者評估了簇3中患者的臨床結(jié)局，并確定與簇1中的患者相比，該組患者的生存狀態(tài)相對較差，以OS和PFI作為終點(diǎn)，而DFI不是終點(diǎn)（圖D）。

5、  拷貝數(shù)擴(kuò)增激活肺腺癌中eRNA的表達(dá)

當(dāng)評估基因組改變對eRNA表達(dá)的影響時，我們觀察到與擴(kuò)增基因組部分呈正相關(guān)（圖A），其中未發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞突變率的顯著相關(guān)性（圖B）。通過整合拷貝數(shù)信息（圖C），我們確定了上述129個上調(diào)的eRNAs中的4個在肺腺癌樣本中被CNA激活，這些eRNAs靶向FOXO6、TERT和PAX9。一個有趣的發(fā)現(xiàn)是FOXO6作為肺腺癌的一個新的驅(qū)動基因的鑒定，觀察到兩個NJLCC中EGFR突變樣本中FOXO6-eRNA和FOXO6的表達(dá)顯著升高，表明FOXO6-eRNA的激活可能是EGFR依賴性的。

結(jié)論：

本研究鑒定的eRNA相關(guān)基因主要參與細(xì)胞周期和免疫系統(tǒng)相關(guān)途徑，基于eRNA的共識聚類進(jìn)一步確定了一種具有免疫缺陷和高水平基因組改變的新型分子亞型，其與肺腺癌患者的不良臨床結(jié)局相關(guān)。eRNAs的全基因組鑒定和表征揭示了肺癌發(fā)生的新調(diào)控因子，這為理解肺癌發(fā)生過程中的eRNAs提供了一個新的生物學(xué)維度，并強(qiáng)調(diào)了基于eRNAs的分子亞型在肺腺癌治療中的臨床實(shí)用性。

參考文獻(xiàn)：

Na Qin1, Zijian Ma, Cheng Wang, et al. Comprehensive characterization of functional eRNAs in lung adenocarcinoma reveals novel regulators and a prognosis-related molecular subtype. Theranostics. 2020; 10(24): 11264-11277.