腎細(xì)胞癌（RCC）是世界上最致命的惡性腫瘤之一，2020年預(yù)計(jì)美國(guó)有七萬新增病例及一萬四千的死亡病例。circRNA已在多種人類癌癥中表現(xiàn)出關(guān)鍵作用，然而其在RCC中的作用仍保有較大程度的未知性。本文發(fā)現(xiàn)circPTCH1通過調(diào)控miR-485-5p/MMP14軸促進(jìn)RCC的侵襲和遷移，于2020年10月發(fā)表于《Theranostics》IF:8.579。

技術(shù)路線如下：

主要結(jié)果如下：

1、RCC細(xì)胞中circPTCH1的芯片分析與鑒定

作者通過對(duì)5種轉(zhuǎn)移性RCC細(xì)胞系和配對(duì)的正常切片的芯片分析，鑒定差異表達(dá)的circRNA，作者挑選的是最顯著的5個(gè)進(jìn)行qRT-PCR分析，最終確認(rèn)只有hsa_circ_0139402在RCC細(xì)胞系中顯著上調(diào)（Figure 1A-B）。其結(jié)構(gòu)組成是來源于宿主基因PTCH1外顯子13和14背向剪切形成，將其命名為circPTCH1。circPTCH1不能被RNase R酶消化，定位于細(xì)胞質(zhì)。

圖1 circPTCH1在RCC細(xì)胞中的表達(dá)及特征分析

2、circPTCH1增強(qiáng)RCC的遷移和侵襲

如圖2所示，敲除circPTCH1后RCC細(xì)胞系的遷移和侵襲減弱，相反，過表達(dá)circPTCH1后RCCC細(xì)胞系的遷移和侵襲增強(qiáng)。

圖2 circPTCH1在體外可增強(qiáng)RCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力

3、在RCC細(xì)胞中circPTCH1作為miR-485-5p的海綿

眾所周知，定位于細(xì)胞質(zhì)的circRNA通常是作為miRNA的海綿發(fā)揮作用，因此本文通過三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同鑒定到9個(gè)潛在的靶向miRNA（Figure 3A-B）。生物素探針實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有miR-485-5p, miR-545-3p, 和miR-330-5p可以被顯著下拉富集（Figure 3C-E）。進(jìn)一步的，只有miR-485-5p在腫瘤中顯著下調(diào)，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)與circPTCH1存在相互結(jié)合作用。這些結(jié)果表明，在RCC細(xì)胞中circPTCH1作為miR-485-5p的海綿發(fā)揮作用。

圖3 circPTCH1作為miR-485-5p的海綿

4、miR-485-5p通過靶向MMP14抑制RCC細(xì)胞的遷移和侵襲

如圖4A-D所示，抑制或過表達(dá)miR-485-5p會(huì)增強(qiáng)或減弱RCC細(xì)胞的遷移和侵襲。隨后，通過4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同確定了39個(gè)潛在的靶基因，其中MP14的表達(dá)最為豐富。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MMP14的表達(dá)水平在腫瘤組織中顯著上調(diào)，與miR-485-5p的表達(dá)負(fù)相關(guān)，且兩者具有相互結(jié)合作用。抑制或過表達(dá)miR-485-5p會(huì)增強(qiáng)或減弱RCC細(xì)胞中MMP14的蛋白表達(dá)水平。這些結(jié)果表明miR-485-5p通過靶向MMP14抑制RCC細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖4 miR-485-5p在體外通過靶向MMP14抑制細(xì)胞遷移和侵襲

5、circPTCH1通過miR-485-5p/MMP14促進(jìn)RCC細(xì)胞的遷移，侵襲，和EMT

作者隨后通過挽救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，circPTCH1的干擾降低了RCC細(xì)胞的遷移能力，然而，與miR-485-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染可以部分消除這種效應(yīng)。此外，敲除circPTCH1降低了MMP14的水平，但共轉(zhuǎn)染miR-485-5p抑制劑可以恢復(fù)期表達(dá)。類似的現(xiàn)象也在N-candherin和Vimentin中觀察到，而E-candherin表達(dá)趨勢(shì)則完全相反。這些結(jié)果表明circPTCH1通過miR-485-5p/MMP14促進(jìn)RCC細(xì)胞遷移，侵襲，和EMT表型。

圖5 circPTCH1通過miR-485-5p/MMP14軸促進(jìn)RCC細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT

6、circPTCH1在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移

與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，如圖6所示，過表達(dá)circPTCH1小鼠體內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)顯著增多，而抑制miR-485-5p則能部分緩解這種效應(yīng)，表明circPTCH1在體內(nèi)通過miR-485-5p/MMP14軸促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和RCC進(jìn)展。

圖6 circPTCH1在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移

總之，本文發(fā)現(xiàn)PTCH1基因13和14號(hào)外顯子反向剪切形成的circPTCH1在細(xì)胞質(zhì)中海綿吸附miR-485-5p，而miR-485-5p可以靶向調(diào)節(jié)MMP14的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)EMT表型，最終導(dǎo)致RCC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移（圖7）。

圖7 原理圖顯示circPTCH1通過miR-485-5p/MMP14軸促進(jìn)RCC轉(zhuǎn)移