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分泌體和外泌體用于肺纖維化治療啦!

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2020-08-04
特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種致命的、無(wú)法治愈的肺間質(zhì)疾病,持續(xù)損傷可導(dǎo)致瘢痕組織形成...

    特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種致命的、無(wú)法治愈的肺間質(zhì)疾病,持續(xù)損傷可導(dǎo)致瘢痕組織形成。隨著纖維化變厚,肺組織失去了促進(jìn)氣體交換和為細(xì)胞提供所需氧氣的能力。目前,除了肺移植外,IPF幾乎沒(méi)有治療選擇,也沒(méi)有有效的治療方法。在這里,作者提出了利用肺球狀細(xì)胞分泌體(LSC-Sec)和外泌體(LSC-Exo)吸入來(lái)治療不同模型的肺損傷和纖維化。本文于2020年2月發(fā)表在Nature Communication(IF:11.878)雜志上。
結(jié) 果:
1、細(xì)胞分泌體減輕博萊霉素(Bleo)誘導(dǎo)的纖維化和凋亡
    小鼠PF模型中肺部炎癥通常持續(xù)7天,并在第9天進(jìn)入纖維化階段,因此,作者在第10天開(kāi)始干預(yù),以保證治療處于PF疾病階段(Fig. 1a)。在首次組織學(xué)檢查后,所有接受Bleo處理組均表現(xiàn)出出血性壞死(Fig. 1b), LSC-Sec或MSC-Sec處理均可減少壞死。由于Bleo誘導(dǎo)DNA損傷,檢測(cè)了細(xì)胞分泌體處理對(duì)細(xì)胞凋亡的影響(Fig. 1c-f)。與PBS組相比,LSC-Sec治療導(dǎo)致肺細(xì)胞凋亡減少(Fig. 1d-f)。LSC-Sec和MSC-Sec處理均通過(guò)保留肺泡上皮結(jié)構(gòu)(Fig. 1g–h)和減少膠原沉積(Fig. 1i–k)來(lái)減少纖維化。只有LSC-Sec能夠減少纖維化面積并將肺泡上皮損傷恢復(fù)到健康水平(sham對(duì)照組)。

圖1 LSC-Sec吸入逆轉(zhuǎn)博萊霉素誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷

2、分泌體吸入促進(jìn)血管和肺泡修復(fù)
    肺泡是遠(yuǎn)端氣道的末端結(jié)構(gòu)。肺泡上皮由肺泡1型上皮細(xì)胞(AT1)和肺泡2型上皮細(xì)胞(AT2)組成,前者介導(dǎo)氣體交換,后者產(chǎn)生和釋放肺表面活性劑、抗氧化劑、細(xì)胞因子/趨化因子和其他對(duì)肺防御、損傷反應(yīng)和穩(wěn)態(tài)重要的分子。因此,檢測(cè)了分泌體處理后Bleo損傷時(shí)AT1和AT2分布的變化,以評(píng)估上皮損傷和挽救(Fig. 2a)。AT1標(biāo)記水通道蛋白5(AQP5)的免疫染色顯示LSC-Sec處理能夠逆轉(zhuǎn)由Bleo引起的上皮損傷(Fig. 2a-d)。 但是,與PBS處理組相比,在LSC-Sec處理組中肺蛋白溶解產(chǎn)物的免疫印跡顯示AQP5蛋白顯著增加(Fig. 2e, f)。 此外,LSC-Sec處理顯著提高了表面活性蛋白C(ProSPC +)陽(yáng)性AT2細(xì)胞的增殖(Fig. 2a-c),該細(xì)胞增殖并分化為AT1細(xì)胞。這種現(xiàn)象在MSC-Sec處理中仍然發(fā)生,但程度較低,與PBS組無(wú)顯著差異。只有LSC-Sec處理能夠增加PF肺中von Willebrand因子(vWF +)陽(yáng)性脈管系統(tǒng)的表達(dá)(Fig. 2a, b)。與PBS組相比,在分泌體處理組中,ProSPC和vWF肺蛋白水平的免疫印跡顯示增加的趨勢(shì)(Fig. 2e, f)。
    同時(shí),通過(guò)測(cè)量α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSMA,指示IPF的成肌纖維細(xì)胞標(biāo)志物)的蛋白質(zhì)水平來(lái)檢查纖維化反應(yīng)(Fig. 2e, f)。與PBS處理的對(duì)照組相比,LSC分泌體處理組αSMA表達(dá)下降。與PBS組相比,兩個(gè)分泌組中肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2的蛋白表達(dá)均呈增加趨勢(shì)。采用細(xì)胞因子陣列來(lái)探究全身細(xì)胞因子表達(dá),作為免疫原性的量度。有趣的是,與PBS對(duì)照相比,LSCSec的促炎性IL-4表達(dá)呈下降趨勢(shì)(Fig. 2g, h)。IL-4是呼吸道疾?。ɡ缦┲写傺坠δ艿闹匾橘|(zhì)。

圖2 LSC-Sec吸入處理促進(jìn)肺泡修復(fù)

3、LSC分泌體治療二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化
    為了評(píng)估LSC-Sec的再生作用可以被應(yīng)用于其他的肺損傷模型,使用二氧化硅誘導(dǎo)肺纖維化。與之前的Bleo研究一樣,使用噴霧器連續(xù)7天給予可吸入細(xì)胞分泌體或生理鹽水(Fig. 3a)。在所有處理組,對(duì)凋亡細(xì)胞的影響均無(wú)顯著差異(Fig. 3b)。但是,與PBS處理組相比,LSC-Sec能夠顯著降低纖維化的嚴(yán)重程度(Fig. 3c, d)。二氧化硅誘導(dǎo)的結(jié)節(jié)周?chē)睦w維化組織強(qiáng)度較小且分布較廣,但在LSC-Sec和MSC-Sec處理組中均持續(xù)存在(Fig. 3c-f)。 與PBS處理相比,細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組處理減少了膠原蛋白沉積并減少了肺泡上皮損傷,盡管膠原蛋白沉積仍顯著高于健康假對(duì)照組(Fig. 3f, g)。
    對(duì)AQP5 + AT1細(xì)胞和ProSPC + AT2細(xì)胞的檢查顯示,在所有二氧化硅損傷的肺中,兩種肺泡標(biāo)記物均無(wú)明顯下降(Fig. 3h-j)。但是,與PBS組相比,LSC-Sec能夠通過(guò)促進(jìn)ProSPC + AT2細(xì)胞表達(dá)并維持AQP5 + AT1細(xì)胞群體來(lái)減少肺泡上皮損傷。表達(dá)AQP5的AT1細(xì)胞不存在纖維化結(jié)節(jié),但ProSPC +和vWF +細(xì)胞的表達(dá)仍然有限(Fig. 3h-k)。

圖3二氧化硅損傷后小鼠肺的修復(fù)和纖維化

4、LSC分泌體和外泌體的蛋白質(zhì)組成
    為了更好的了解上述觀察到的LSC-Sec的再生能力的分子過(guò)程,作者嘗試構(gòu)建它的蛋白組的組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然這三株LSC細(xì)胞系來(lái)自不同性別、種族和年齡的個(gè)體(圖4a),但卻具有非常相似的蛋白質(zhì)組(Fig. 4a)。在共享的蛋白中,29.6%被標(biāo)注為具有已知分泌膜受體的胞外蛋白,47.5%被標(biāo)注為不存在已知分泌途徑的胞質(zhì)蛋白(Fig. 4b)。在三個(gè)LSC-Sec中鑒定的103個(gè)細(xì)胞外蛋白中,有20個(gè)的相對(duì)豐度較高(Fig. 4c)。此外,在LSC-Sec中發(fā)現(xiàn)的102種常見(jiàn)細(xì)胞外蛋白中,約有一半也在LSC-Exo中發(fā)現(xiàn)(Fig. 4e)。Fig. 4d和Fig. 4f分別是LSC-Sec和LSC-Exo中鑒定的胞外蛋白的GO分析。

圖4 LSC-Sec和LSC-Exo的蛋白組分析

5、LSC外泌體的治療作用
    通過(guò)大小、形態(tài)和常見(jiàn)的外泌體標(biāo)記(CD63、CD81和TSG101)對(duì)LSC-Exo和MSC-Exo進(jìn)行了表征(Fig. 5a-c)。所有分泌體和外泌體處理組均在維持正常肺結(jié)構(gòu)(Fig. 5e-f)和減少纖維化(Fig. 5h)、肺凋亡和膠原沉積(Fig. 5j-i)方面均顯示出治療效果。值得注意的是,與PBS處理組相比,只有LSC-Sec和LSC-Exo顯著降低了膠原沉積。此外,只有LSC-Sec可顯著降低纖維化(Ashcroft評(píng)分)至與sham對(duì)照組相似的水平。治療組的肺αSMA蛋白含量沒(méi)表現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)(Fig. 5j)。LSC-Sec和LSC-Exo處理減緩了肺泡上皮和血管損傷,并降低纖維化反應(yīng),表現(xiàn)為AQP5 +和vWF +細(xì)胞增加和αSMA +細(xì)胞減少(Fig. 5k-n)。

圖5外泌體吸入處理肺纖維化大鼠的治療潛力

6、外泌體治療改善Bleo誘導(dǎo)后的肺功能
    作者檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMP-2和MCP- 1的表達(dá)顯著響應(yīng)LSC-Sec和LSC-Exo治療(Fig. 6a)。接下來(lái),預(yù)測(cè)LSC-Sec和LSC-Exo治療受損肺結(jié)構(gòu)和纖維化的臨床影響(Fig. 6b)。與預(yù)期一樣,吸氣量(IC)、阻力(Rrs)、順應(yīng)性(Crs)、遲滯面積、用力呼氣容積(FEV)與用力肺活量(FVC)之比較基線均下降了(Fig. 6c-e, g, h),且呼吸彈性(Ers),順應(yīng)性的倒數(shù),在中點(diǎn)分析時(shí)增加(Fig. 6f)??傊?,所有Bleo動(dòng)物的肺功能持續(xù)受損,如預(yù)期的那樣,肺損傷,導(dǎo)致組織硬度和彈性反沖增加。
    在終點(diǎn)分析中,通過(guò)分泌體和外泌體治療后僅部分恢復(fù)了肺功能。LSC-Sec,LSC-Exo或MSC-Exo治療后,吸氣能力和呼吸順應(yīng)性均顯著改善(Fig. 6c-e)。僅使用LSC-Exo治療,呼吸阻力有明顯恢復(fù)(Fig. 6d)。治療后彈性,滯后面積和FEV / FVC比均無(wú)明顯變化。

圖6外泌體治療改善Bleo誘導(dǎo)后的肺功能和外泌體miRNA分析

7、LSC和MSC外泌體的microRNA分析
    對(duì)LSC-Exo和MSC-Exo進(jìn)行了小RNA深度測(cè)序,并分析了它們的miRNA組成的差異。在這些LSC-Exo和MSC-Exo樣本中,總共檢測(cè)到超過(guò)600種獨(dú)特的miRNA,這表明外源性miRNA在這些樣本中可能具有多種調(diào)控作用。除去豐度較少的miRNA后,仍有142個(gè)miRNA用于進(jìn)行下游分析(Fig. 6i, j)。在兩種外泌體類(lèi)型中總共發(fā)現(xiàn)42個(gè)差異表達(dá)的miRNAs。LSC-Exo中上調(diào)最多的miRNAs是hsa-miR- 99a-5p和hsa-miR-100-5p(Fig. 6j)。它們也是LSC-Exo中含量最高的兩個(gè)miRNAs,屬于miR-99家族(Fig. 6k)。

圖7外泌體治療改善Bleo誘導(dǎo)后的外泌體miRNA分析

    總而言之,本文報(bào)告了新型脫細(xì)胞治療劑,即LSC-Sec和LSC-Exo,在嚙齒動(dòng)物中博萊霉素誘導(dǎo)和二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化治療中被證明是安全有效的。本文證明,LSC-Sec介導(dǎo)的再生機(jī)制可能與外泌體,MMP-2活性以及細(xì)胞分泌物中發(fā)現(xiàn)的大量蛋白質(zhì)有關(guān)。分泌體和外泌體的免疫原性遠(yuǎn)低于其親本,并且這些因子的施用可以克服干細(xì)胞的局限性,同時(shí)保持相似的治療效果。在LSC-Sec中對(duì)miR-30a和miR-99和let-7家族的miRNA的鑒定值得進(jìn)一步研究,因?yàn)橐阎猰iR-30a在IPF患者以及miR-99和let-7家族中被下調(diào)。IPF目前是一種不可治愈的呼吸系統(tǒng)疾病,發(fā)病率和死亡率均在上升,目前沒(méi)有有效的療法,LSC-Sec和LSC-Exo為IPF療法的發(fā)展提供了新的希望。


 
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