導語
    細胞外囊泡(EVs)已經成為細胞間通訊的新型介質，能夠穩(wěn)定轉移治療性microRNAs (miRNAs)，因此，EVs作為一種用于癌癥治療的miRNA傳遞系統具有巨大的潛力。此外，隨著含有mirna的EV被分泌到循環(huán)中，血漿EV中包含的mirna可能成為疾病的理想生物標志物。本文將描述一種潛在的腫瘤抑制因子miRNA, miR-101，并探討通過EVs傳遞miR-101用于轉移性骨肉瘤體內治療的潛力，以及血漿EV-packaged miR-101 (EV-miR-101)水平預測骨肉瘤轉移的潛在價值。
技術路線                   
1.通過原位雜交(ISH)研究miR-101在骨肉瘤中的表達與骨肉瘤進展的關系
2.利用體內模型進一步研究了miR-101的潛在抑制作用
3.利用預測軟件分析，采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)、western blotting和雙熒光素酶分析探討miR-101在骨肉瘤中的作用機制。
4.將脂肪組織來源的間充質基質細胞(AD-MSCs)與慢病毒顆粒轉導，獲得富含mir -101的EV。
5.采用Transwell實驗和骨肉瘤肺轉移模型觀察富mir -101的EVs對骨肉瘤侵襲性和轉移的影響。
6.應用qRT-PCR檢測骨肉瘤患者和健康對照組血漿EV-miR-101水平。
研究結果:
1.miR-101的下調與骨肉瘤患者的轉移進展和不良預后相關
    探討miR-101在骨肉瘤轉移中的作用，進行了原位雜交(in situ hybridization, ISH)來評估m(xù)iR-101的表達。數據顯示，miR-101在轉移性骨肉瘤標本中的表達明顯低于非轉移性骨肉瘤標本。根據骨肉瘤標本中miR-101表達的ISH分數，114例骨肉瘤患者被分為高miR-101表達組和低miR-101表達組。如表所示，與高miR-101表達組相比，低miR-101表達組轉移率更高，臨床分期更晚。此外，低miR-101表達組的總生存時間也比高miR-101表達組短?？傊?，miR-101表達下降預示預后不良，可能是與骨肉瘤轉移的刺激有關。

 
2.在體內模型中，miR-101對骨肉瘤轉移具有抑制作用
    探討miR-101是否能抑制體內肺轉移，通過慢病毒載體介導的轉導構建穩(wěn)定表達miR-101的骨肉瘤細胞系，并通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測其轉導效率。建立體內骨肉瘤轉移模型,sosp - 9607細胞表達mir – 101。病毒顆粒通過尾靜脈注入裸鼠實驗。7周后處死小鼠，結果顯示，與注射了nc轉導細胞系的小鼠相比，注射了SOSP-9607-101或Saos-2-101細胞的小鼠與注射了nc轉導細胞系的小鼠相比，轉移性肺結節(jié)明顯減少，肺重量明顯降低。此外，為了排除miR-101對細胞增殖的影響，這可能影響體內肺轉移的形成，我們使用CCK-8法評估慢病毒載體介導轉導后的SOSP-9607-101和Saos-2-101細胞的增殖，并與NC細胞進行比較。結果miR-101的表達對這些骨肉瘤細胞的增殖幾乎沒有影響。

 
3.BCl6是miR-101在骨肉瘤細胞中的直接靶標          
    鑒于mir - 101之間的序列同源性和3翻譯區(qū)(3 UTR) BCL6, 相對于數控同行， mir - 101表達升高的影響B(tài)CL6 mRNA和蛋白表達。此外，進行了雙熒光素酶報告基因實驗，結果顯示，miR-101表達的升高顯著抑制了143B細胞和Saos-2細胞中野生型BCL6 3 UTR報告基因的熒光素酶活性，但未抑制突變型報告基因的活性。qRT-PCR分析15對匹配的骨肉瘤組織和相鄰正常組織中BCL6的表達，發(fā)現骨肉瘤組織中BCL6 mRNA水平較相鄰正常組織升高。在15例骨肉瘤標本中，研究了miR-101和BCL6表達的相關性，結果顯示，miR-101表達與BCL6 mRNA表達呈負相關。與miR-101的作用相比，BCL6顯著增強骨肉瘤細胞的侵襲和遷移，BCL6的異位表達拯救了miR-101對骨肉瘤細胞侵襲和遷移的抑制。總之，這些數據表明，miR-101通過直接靶向BCL6來抑制細胞的侵襲和遷移。

  
4.miR-101可以被成功包裝成脂肪組織來源的間充質基質細胞(AD-MSC)來源的EV
    通過流式細胞術檢測包括CD31、CD34、CD44、CD45、CD90和CD105在內的陽性和陰性間充質干細胞(圖S2A)的表達，確認分離的AD-MSCs的純度。多重感染(MOI)的慢病毒載體介導轉導48小時后，在AD-MSCs中觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的表達。重復流式細胞術分析間充質干細胞標記物的表達，并觀察到工程化的AD-MSCs與天然的AD-MSCs之間無明顯差異。研究AD-MSCs的多向分化潛能，誘導其分化為脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞分別用油紅O、阿利新藍、茜素紅S染色鑒別分化的細胞。AD-MSCs與原生的AD-MSCs具有相同的多向分化潛能。miR-101在表達miR-101 (ad - ms -101)的AD-MSCs中的表達較經qRT-PCR轉導的NC病毒顆粒(ad - ms -NC)的AD-MSCs中的表達增加。差速離心從條件培養(yǎng)基中獲得EV，透射電鏡觀察ad - msc衍生的EV和納米顆粒跟蹤分析。western blotting檢測EVs的載脂蛋白B (APOB)蛋白標記物。ad - msc -101衍生EVs (AD-MSC-101-EVs)中miR-101的含量顯著高于AD-MSC-NC衍生EVs (AD-MSC-NC-EVs)。

 
5.體外培養(yǎng)的AD-MSCs中，mir -101富集的EV可抑制骨肉瘤細胞的侵襲和遷移
    143-B和Saos-2細胞有效地吸收了AD-MSC-101-EV，如143B和Saos-2細胞中miR-101水平的增加所證明的。隨后，這種攝取導致BCL6 mRNA和蛋白質表達降低。與用AD-MSC-NC-EVs或等體積的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）處理的細胞相比，用AD-MSC-101-EVs處理的骨肉瘤細胞顯示出顯著降低的侵襲和遷移能力。143B和Saos-2細胞遷移的傷口愈合測定結果與Transwell測定的結果一致。 

6.AD-MSCs中富含mir -101的EV可抑制體內骨肉瘤轉移
    驗證AD-MSCs中富含mir -101的EV是否具有治療體內骨肉瘤轉移的臨床潛力，將穩(wěn)定表達熒光素酶(143B-luci)的143B細胞注射到裸鼠脛骨近端形成腫瘤。2周后，AD-MSC-101-EVs、AD-MSC-NC-EVs或等量PBS分別注射到小鼠尾靜脈，每周2次，共1個月。與接受AD-MSC-NC-EVs或PBS均出現肺轉移的小鼠相比，接受AD-MSC-101-EVs的6只小鼠中只有2只在腫瘤細胞注射后7周內出現肺轉移。在小鼠犧牲后，與接受AD-MSC-NC-EVs或PBS處理的小鼠相比，接受AD-MSC-101-EVs的小鼠肺轉移結節(jié)數量和肺重量明顯減少。評價EV治療的體內安全性，將15只裸鼠隨機分為3組(每組5只)，分別給予AD-MSC-101-EVs、AD-MSC-NC-EVs或等量PBS。在最后注射治療1周后，所有小鼠均被處死。血清學指標檢測三組間差異無統計學意義，提示EV治療對肝腎功能無不良影響。對主要臟器進行H&E染色，發(fā)現分別給予AD-MSC-101-EVs、AD-MSC-NC-EVs或PBS處理的小鼠無明顯毒性。

 
7. 血漿EV-miR-101顯示出作為骨肉瘤診斷性生物標志物的潛力
    對差異表達的測序的結果，血漿樣本中一個骨肉瘤病人顯示了mir – 101在血漿EV的存在,以及減少的mir - 101等離子EVs的骨肉瘤病人與健康控制。進一步驗證診斷潛在的EV - mir - 101,共檢測61例骨肉瘤患者(41例，診斷時無轉移)和健康對照組(20例)的血漿標本。與健康對照組相比，骨肉瘤患者的EV-miR-101表達較低。此外，與無轉移的骨肉瘤患者(n=27)相比，有轉移的患者(n=14)的miR-101水平更低然后進行受試者工作特性(Receiver operating characteristic, ROC)曲線分析，以評估血漿EV-miR-101作為診斷骨肉瘤的非侵入性生物標志物的潛在價值。結果表明，EV-miR-101水平可有效區(qū)分骨肉瘤患者與健康對照組(ROC曲線下面積)。另外，血漿EV-miR-101水平可以區(qū)分有轉移的骨肉瘤患者和無轉移的骨肉瘤患者。此外，血漿EV-packaged let-7i-5p (EV-let-7i-5p)的水平也被檢測，并顯示健康對照組和骨肉瘤患者之間沒有顯著差異。而且，無轉移骨肉瘤患者與有轉移骨肉瘤患者的血漿EV-let-7i-5p水平無顯著差異。這些結果提示EV-let-7i-5p可作為未來骨肉瘤標志物研究的內源性對照。

總結 :
    證明了miR-101是骨肉瘤侵襲性和轉移的明確抑制因子，這些作用至少部分是通過調控BCL6介導的。來自AD-MSCs的EV顯示出作為miR-101體內傳遞載體的巨大潛力。血漿EV-miR-101水平也具有作為骨肉瘤轉移的新的生物標志物的激動人心的潛力，盡管這項研究由于這些樣本的稀少而受到樣本量的限制。需要進一步的研究來確定血漿EV-miR-101水平在其他更大的患者群體中的臨床價值。但其結果為EV-miR-101在骨肉瘤轉移患者新的診斷和治療策略中的潛在應用提供了見解。