隨著第二代測序技術(shù)的發(fā)展，small RNA(包括miRNA，ncRNA，siRNA，，piRNA, tRFRNA)在疾病中的研究如雨后春筍般展開，環(huán)狀RNA相比于線性化的RNA而言circRNA表現(xiàn)出了非同一般的穩(wěn)定性，circRNA較多的作為miRNA的海綿體（sponge）而存在，且在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。如何研究在這樣的形勢下保持嚴(yán)謹(jǐn)與不落俗套，建立好的疾病模型與選擇好的實(shí)驗(yàn)思路尤為重要，2018年5月，上海第九人民醫(yī)院矯形外科的研究人員在Ann Rheum Dis (IF=12.35)上發(fā)表了一篇名為 “Circular RNA VMA21 protects against intervertebral disc degeneration through targeting miR-200c and X linked inhibitor-of-apoptosis protein”的文章。為我們在疾病模型中研究circRNA提供了很好的思路借鑒。

本文的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路如下： miRNA差異表達(dá)→預(yù)測靶基因 mRNA→由ceRNA機(jī)制引出 circRNA→細(xì)胞模型&大鼠模型證明→疾病IVDD

機(jī)制圖

結(jié)果

1. miR-200c在退行性髓核組織（NP）中上調(diào)，參與調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞的生存能力和功能

利用數(shù)據(jù)庫GSE45856獲得的微陣列數(shù)據(jù)，對(duì)退行性的髓核組織中miRNA的差異表達(dá)進(jìn)行了研究。miRNA芯片檢測到的2672個(gè)miRNA中，有14個(gè)miRNA在退行性髓核組織中上調(diào) (圖1A)。選擇這些候選miRNA， qRT-PCR分析驗(yàn)證。miR-200c、miR-130b-5p和mir -2355 -5p在退行性NP組織中顯著上調(diào)，其中miR-200c的上調(diào)水平最高(圖1B)。這些miRNA在腰椎間盤退變（IVDD）大鼠模型中的表達(dá)模式與患者樣本一致(圖1C)。Northern blot也證實(shí)了退行性NP組織中miR-200c水平的升高(圖1D)。miR -200c過表達(dá)細(xì)胞(圖1E)顯示凋亡細(xì)胞百分比增加(圖1F)， caspase活化升高，MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5表達(dá)增加，膠原蛋白II和aggrecan表達(dá)減少(圖1G)。這些結(jié)果提示miR-200c在髓核細(xì)胞中的促凋亡和促代謝效應(yīng)。值得注意的是作者選擇了NP細(xì)胞（髓核細(xì)胞），一種在腰間盤最豐富的細(xì)胞類型，而且分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)+細(xì)胞因子，調(diào)控腰間盤的微環(huán)境。

2. miR-200c通過抑制其靶點(diǎn)XIAP調(diào)控NPC的生存能力和功能

生物信息學(xué)預(yù)測凋亡通路調(diào)控因子XIAP是miR-200c的潛在靶點(diǎn)(圖2A)。退行性NP組織中上調(diào)的miRNA與凋亡信號(hào)通路調(diào)控的相關(guān)性。野生型XIAP報(bào)告基因的熒光素酶信號(hào)被miR-200c抑制，而引入突變則消除了miR-200c的抑制作用(圖2B)。與對(duì)照組相比，退行性NP組織中XIAP表達(dá)減少(圖2C)。miR-200c的升高降低了XIAP的表達(dá)，而內(nèi)源性miR-200c的降低增加了NPC中XIAP的表達(dá)(圖2D)。TNF-αXIAP和IL-1β治療誘導(dǎo)了在髓核細(xì)胞的XIAP蛋白質(zhì)的減少,而mir - 200 c拮抗劑消除了這種減弱作用(圖2 E)。我們進(jìn)一步研究了miR-200c和XIAP在npc中的功能是否相關(guān)。此外, 接受TNF-α和IL-1β治療時(shí)，XIAP的缺失明顯中和了mir - 200 c拮抗劑在髓核細(xì)胞中的拮抗劑作用 (圖2 F,G),表明mir - 200 c通過XIAP發(fā)揮其功能。

3. CCircVMA21充當(dāng)了miR-200c的海綿

starBase預(yù)測miR-200c具有多個(gè)環(huán)狀RNA的結(jié)合位點(diǎn)。我們根據(jù)前20名的預(yù)測環(huán)狀RNA評(píng)分進(jìn)行篩選。通過qRT-PCR分析，circVMA21在NP組織中得到驗(yàn)證(圖3A)。退行性NP組織中CircVMA21水平明顯降低(圖3B)。 FISH也證實(shí)了這一結(jié)果(圖3C)。使用RNAhybrid對(duì)circVMA21與miR-200c的序列進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)circVMA21含有6個(gè)miR-200c的假定靶點(diǎn)(圖3D,)。其中5個(gè)位點(diǎn)通過熒光素酶檢測得到驗(yàn)證(圖3E)。相對(duì)于mRNA(圖3F)，該環(huán)狀RNA豐富且耐RNAse R處理。North blot分析顯示線性VMA21是通過線性探針檢測的，而不是在剪接位點(diǎn)的圓形探針檢測(圖3G)。pull down試驗(yàn)顯示，與引入破壞miR-200c與circVMA21結(jié)合位點(diǎn)的miR-200c突變相比，miR-200c富集了circVMA21(圖3H)。CircVMA21來源于VMA21基因的最后一個(gè)外顯子，主要轉(zhuǎn)錄mRNA的3’UTR。我們發(fā)現(xiàn)它擁有69個(gè)AGO2蛋白結(jié)合位點(diǎn)。交聯(lián)和免疫沉淀(CLIP)序列顯示至少30個(gè)AGO2結(jié)合區(qū)域位于VMA21 mRNA的3'UTR。其中5個(gè)區(qū)域與miR-200c的結(jié)合位點(diǎn)重疊(圖3I)。AGO2免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性AGO2下調(diào)的circVMA21在轉(zhuǎn)染miR-200c的NPCs中富集，但未富集其突變體(圖3I)，提示miR-200c促進(jìn)了AGO2與circVMA21之間的聯(lián)系。North blot分析顯示circVMA21可以反向拉低miR-200c(圖3J)。結(jié)果表明circVMA21能夠直接與髓核細(xì)胞中中的miR-200c結(jié)合。

4. circVMA21通過靶向miR-200c和XIAP在髓核細(xì)胞中發(fā)揮作用

腺病毒circVMA21感染導(dǎo)致NPCs中circVMA21過表達(dá)，siRNA抑制circVMA21表達(dá)(圖4A)。North blot分析證實(shí)了外源性circVMA21攝入后circVMA21的數(shù)量增加(圖4B)。circVMA21的上調(diào)增加了XIAP的表達(dá)，而circVMA21的下調(diào)導(dǎo)致了XIAP表達(dá)的降低(圖4C)。circVMA21上調(diào)抑制了miR-200c對(duì)XIAP表達(dá)(圖4D)和活性(圖4E)的抑制作用。綜上所述，這些結(jié)果表明circVMA21作為miR-200c的功能性海綿來調(diào)節(jié)XIAP的表達(dá)和活性。在炎性細(xì)胞因子治療后，qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)NPCs中circVMA21水平降低，miR-200c水平升高，均可通過上調(diào)circVMA21逆轉(zhuǎn)(圖4F,G)。因此，circVMA21的強(qiáng)制表達(dá)抑制了這些細(xì)胞因子的凋亡和分解代謝作用，促進(jìn)了膠原蛋白II和aggrecan的表達(dá)(圖4H)。

5. 在大鼠模型中，椎間盤內(nèi)注射circVMA21可以緩解IVDD

通過穿刺成功建立了IVDD大鼠模型(圖5A)。在穿刺1周和5周后，腺病毒人circVMA21使用33針細(xì)針注射入穿刺的IVD中。在第1、5和9周的x光檢查顯示，所有IVD穿刺組的椎間盤間隙隨時(shí)間逐漸縮小。注射后各時(shí)間點(diǎn)，circVMA21組與未注射組、circVMA21-mut組椎間盤高度指數(shù)百分比(%)無顯著差異(圖5B、C)。注射9周后，circVMA21組IVDs MRI退變評(píng)分明顯低于未注射組(圖5D、E)。在體內(nèi)RNA FISH發(fā)現(xiàn)circVMA21位于NP區(qū)域(圖5F)。注射腺病毒circVMA21后，退行性NP組織中的circVMA21水平顯著升高，miR-200c水平下降(圖5G,H)。腺病毒circVMA21的注射緩解了NP的退行性變化，增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡和分解代謝反應(yīng)，降低了IVDD大鼠模型中ECM的組成(圖5I,J,K,)。9周時(shí)，非注射組的組織學(xué)評(píng)分明顯高于circVMA21組(圖5L,M)。綜上所述，這些結(jié)果揭示了升高的circVMA21水平對(duì)抑制鼻咽癌凋亡、抑制ECM分解代謝、促進(jìn)NP內(nèi)合成代謝以及在體內(nèi)緩解IVDD的積極作用。